ID1/ID3在诱导成纤维细胞重编程为施万细胞促进神经再生的应用

摘要

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及ID1和ID3在成纤维细胞重编程为施万细胞及促进周围神经再生中的应用，该应用使用ID1或ID3重编程的施万细胞或ID1或ID3过表达的病毒载体，能够促进创伤后的神经再生，促进创伤愈合，提高创伤愈合质量，是解决创伤后局部神经再生或周围神经病变导致的难愈性创伤的有效途径。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及ID1/ID3在诱导成纤维细胞重编程为施万细胞促进神经再生中的应用。

背景技术

创伤修复是一个复杂的生物学过程，包含多种有序的细胞生物学过程如再上皮化、血管新生等。其中神经支配对创面愈合影响巨大，既往研究表明病理性的或创伤所致的神经支配的障碍会导致创面愈合的延缓甚至导致不愈合。此外在创伤后局部组织的痛觉、温度觉和触觉的恢复对提高患者的生活质量至关重要，因此提高创伤后局部神经修复对治疗难愈性创面和提高创面愈合质量有着重要的临床意义。

既往的研究表明施万细胞在周围神经损伤修复中发挥着重要的作用。在神经损伤后，施万细胞与损伤部位及其周围的各种细胞相互作用，参与碎片清除，神经修复和神经再生等重要过程。此外，施万细胞还能分泌神经营养因子促进神经再生。既往研究发现周围神经损伤后通过移植外源性的施万细胞能有效的促进周围神经的再生。但是细胞移植治疗所需的大量施万细胞存在细胞供应和配型的局限性，可能导致的免疫排斥反应。因此通过成体体细胞如成纤维细胞重编程产生施万细胞，可有效突破免疫匹配和细胞来源瓶颈，使之成为一项有重大前景的可用于临床的细胞来源。

分化抑制因子(inhibitor of DNA binding，ID)家族是一组进化保守的蛋白质。在哺乳动物中发现了四个ID蛋白，即ID1至ID4。在各种细胞类型中，ID蛋白的表达范围广泛但差异很大。既往研究发现ID蛋白能够促进细胞周期进程，加速细胞迁移，抑制不同类型祖细胞的分化并减少细胞衰老，因此ID蛋白参与了体内多种病理生理过程如神经发生、干细胞维持、血管生成、器官发育、肿瘤发生和转移、能量代谢等。但ID蛋白分子在成体细胞重编程中的作用未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供ID1/ID3在诱导成纤维细胞重编程为施万细胞促进神经再生的应用，该应用使用ID1或ID3重编程的施万细胞或ID1或ID3过表达的病毒载体，能够促进创伤后的神经再生，促进创伤愈合，提高创伤愈合质量，是解决创伤后局部神经再生或周围神经病变导致的难愈性创伤的有效途径。

具体的技术方案是：

分化抑制因子在制备治疗周围神经损伤的药物中的应用，所述应用是分化抑制因子通过诱导成纤维细胞重编程为施万细胞促进神经再生。

所述分化抑制因子为ID1或/和ID3。

所述施万细胞包括ID1或ID3诱导，或ID1和ID3同时诱导所得。

所述成纤维细胞为人源性或鼠源性的成体，或胚胎成纤维细胞。

所述周围神经损伤为创伤后局部神经损伤。

所述创伤后局部神经损伤为周围神经损伤包括坐骨神经全层切断，皮肤全层损伤导致的局部神经损伤，或其它类型创伤导致的组织局部神经损伤。

所述创伤包括皮肤机械创伤和其它组织的机械创伤，或者皮肤或其它组织的烧伤、复合伤。

本发明中所涉及的ID1和ID3包含编码ID1和ID3的蛋白基因序列重组载体、重组微生物等。ID1或ID3基因在成纤维细胞中过表达后能提高成纤维细胞中施万细胞标志物s100β和Gfap的表达，同时促进背根神经节神经元的轴突延伸。

本发明中所涉及的成纤维细胞包含但不仅限于成体组织分离的原代成纤维细胞，对于胚胎期分离的成纤维细胞也在本发明保护范围之内。

本发明中涉及的创伤包括但不仅限于皮肤机械创伤，其它组织的机械创伤，或者皮肤或其它组织的烧伤、复合伤等也在本发明保护范围之内。ID1和ID3诱导成纤维细胞重编程为施万细胞后，移植诱导的施万细胞能有效促进创伤后局部的神经再生，加快创伤愈合速度，减轻创面胶原沉积，提高创面愈合质量。

本发明中涉及的周围神经损伤包括但不仅限于坐骨神经损伤、创伤后局部神经损伤。ID1和ID3诱导成纤维细胞重编程为施万细胞后，移植诱导的施万细胞能有效地促进损伤的周围神经的再生，减轻神经支配的肌肉的萎缩。

本发明还是直接使用ID1和ID3的病毒载体到创伤局部，可促进创伤局部的神经修复，加快创伤愈合速度、创伤后再上皮化和肉芽形成。

申请人在建立全层皮损创面(能通过正常的创面修复进程达到愈合)和体外成纤维细胞划痕损伤模型的基础上，通过组织病理学技术和分子生物学技术证实创伤后成纤维细胞中的ID1和ID3表达明显增强。

在成纤维细胞中过表达ID1或ID3，发现ID1和ID3均可提高成纤维细胞的增殖能力和迁移能力，同时还将成纤维细胞重编程为施万细胞表达Gfap和s100β。将诱导后的施万细胞与背根神经节神经元共培养后发现，与未诱导的成纤维细胞相比较，诱导后的施万细胞能更好地促进神经元的轴突生长。

申请人的实验验证，将ID1或ID3诱导后的施万细胞局部移植到全层皮肤损伤后的创伤组织后，能促进局部神经修复，能加快创面愈合速度，减少创面的胶原沉积，提高创面愈合质量；将ID1或ID3病毒载体直接注射到耳朵创伤局部，发现较对照病毒载体，ID1或ID3病毒载体移植可促进创伤局部的神经修复，加快创伤愈合速度、创伤后再上皮化和肉芽形成；将ID1或ID3诱导后的施万细胞局部移植到坐骨神经全层切断模型的断端处，发现ID1或ID3诱导后的施万细胞，相比较空白移植和对照成纤维细胞移植，有更好的促进神经再生，并减轻神经支配处肌肉萎缩的作用。

附图说明

图1为本发明所述创伤后成纤维细胞ID1和ID3表达情况；

图2为本发明所述ID1和ID3诱导成纤维细胞为施万细胞情况；

图3为本发明所述ID1或ID3诱导的施万细胞促进背根神经节神经元的轴突生长情况；

图4为本发明所述ID1或ID3诱导的施万细胞促进局部神经再生和创面愈合情况；

图5为本发明所述ID1或ID3诱导的施万细胞促进坐骨神经损伤修复情况；

图6为本发明所述ID1或ID3慢病毒载体促进局部神经再生和创伤愈合情况。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

本发明中使用的小鼠为C57小鼠，大鼠为SD大鼠，均购于陆军军医大学实验动物中心；

ID1、ID3、Tuj1、s100β抗体，购于Abcam公司，

Gfap抗体购于武汉三鹰公司；

荧光二抗、HRP二抗、双抗、结晶紫染色液均购于碧云天生物技术有限公司；

B27，L-glutamine,胎牛血清购于Gibco公司；

4％多聚甲醛、PBS购于博士德生物技术有限公司；

水合氯醛购于上海生工生物技术有限公司；I型胶原酶购于Worthington公司；

胰酶、DMEM培养基购于Hyclone公司，

Neurobasal

流式分选使用BD公司的FACS AriaIII进行；

免疫印迹使用百乐公司的电泳仪进行；

图像采集应用莱卡公司的DM3000显微镜进行；

免疫印迹法，细胞和组织免疫荧光染色法，集落形成能力检测法，HE染色法及其它未明确记载的实验步骤和条件参照文献(Chen,Z.,et al.(2019)."Fibrogenicfibroblast-selective near-infrared phototherapy to control scarring."Theranostics 9(23):6797-6808)进行。

本发明除上述试剂以外的其他试剂均采用市售的生物级试剂。

实施例1 ID1和ID3在创伤后成纤维细胞中的表达

小鼠皮肤全层切除损伤模型制作：选取8～12周，体重20g左右，C57雌鼠，创伤前一天常规备皮脱毛，以1％水合氯醛腹腔注射麻醉(5ml/kg)，在小鼠背部正中线轻轻提起小鼠背部皮肤，用直径约1cm全层皮肤打孔器致创。

收集小鼠全层皮肤缺损创面第1,3,5,7,9,12,15,20天的标本，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，5μm切片，切片用于ID1和ID3蛋白免疫组化染色，并以PBS代替一抗，作为阴性对照组，实验结果见图1A，B，切片染色显示，创面新生肉芽组织成纤维细胞中从3天开始表达ID1和ID3。

体外成纤维细胞划痕创伤模型制作：选取组织分离培养的人真皮成纤维细胞(6代以内)，接种于预置圆形细胞爬片的24孔板内，用培养条件：DNEM+10％胎牛血清+双抗，每3天常规换液1次，培养至长满状态后再培养2天，用200ul枪头沿24孔板直径划一道横线致创。

收集创伤后6,12,24,36,48,60,72h的细胞爬片，细胞免疫荧光染色ID1和ID3，并以PBS代替一抗，作为阴性对照组，实验结果见图1C,D，染色显示划痕创伤后成纤维性细胞中ID1和ID3的表达在创伤后12h明显增强。

收集创伤后24，36，48，72h的细胞蛋白，免疫印迹法，检测ID1和ID3表达，实验结果见图1E，结果显示创伤后成纤维细胞中的ID1和ID3表达均明显增强，提示成纤维细胞中ID1和ID3的高表达在创伤修复中起着重要的作用。

实施例2 ID1或ID3诱导成纤维细胞为施万细胞

将人和小鼠的真皮成纤维细胞接种与24孔板，待细胞融合度达到40％，分别接种由吉玛基因生物技术有限公司构建并纯化的人和小鼠慢病毒载体Vector-mCherry、ID1-mCherry、ID3-mCherry，病毒颗粒数/细胞数(MOI)为100，转染后，待细胞完全融合后，进行传代处理，待细胞扩增1代后，流式细胞分选出mCherry对照成纤维细胞，ID1过表达成纤维细胞和ID3过表达成纤维细胞。

集落形成实验检测ID1和ID3过表达细胞的增殖能力：将人和小鼠对照、ID1过表达和ID3过表达成纤维细胞按照1×10

使用细胞免疫荧光染色法检测细胞中的Gfap，S100β：将对照成纤维细胞，ID1过表达和ID3过表达的成纤维细胞接种到细胞爬片，培养24h后，用4％多聚甲醛固定20min，细胞免疫荧光染色，并以PBS代替一抗，作为阴性对照组，实验结果如图2B，发现ID1、ID3能诱导成纤维细胞增强表达施万细胞标志物Gfap，S100β。

使用免疫印迹法检测细胞中的Sox2，Nestin，Gfap，S100β：将对照成纤维细胞，ID1过表达和ID3过表达的成纤维细胞接种后，当细胞融合度达到90％以上，提取全细胞蛋白，免疫印迹法检测对照成纤维细胞，ID1过表达和ID3过表达的成纤维细胞内的Sox2，Nestin，Gfap，S100β表达，结果发现ID1、ID3能诱导成纤维细胞表达Sox2，Nestin，Gfap，S100β，结合免疫荧光染色结果提示ID1、ID3能诱导成纤维细胞为施万细胞。

实施例3 ID1或ID3诱导的施万细胞促进背根神经节神经元的轴突生长

大鼠背根神经节神经元分离：选取8～12周，体重200g左右，SD雌鼠，断颈处死后，分离第4-5节段的背根神经节，应用I型胶原酶(0.25％)+0.01％胰酶，37℃摇床作用40min，通过75um的细胞筛后将获得的细胞培养于Neurobasal

共培养背根神经节神经元和诱导后的施万细胞：应用实施例2中流式分选后的对照、ID1和ID3过表达的成纤维细胞，按照1×10

实施例4 ID1或ID3诱导的施万细胞促进放射复合伤皮肤创面神经修复和创伤愈合

放射复合伤皮肤创面模型制作：选取8～12周，体重20g左右，C57雌鼠，创伤前一天常规备皮脱毛。给与全身5Gy X射线照射，照射后以1％水合氯醛腹腔注射麻醉(5ml/kg)，在小鼠背部正中线轻轻提起小鼠背部皮肤，用直径约1cm全层皮肤打孔器致创。

应用实施例2中获得的对照成纤维细胞、ID1或ID3诱导的施万细胞以2×10

取材创伤后19天的创面组织，通过免疫荧光染色，染色创面组织中神经纤维标志物Tuj1,结果如图4C，发现ID1或ID3诱导的施万细胞移植的创面组织中Tuj1的表达明显高于PBS移植和对照成纤维细胞移植组，提示ID1或ID3诱导的施万细胞能明显促进创伤后局部神经修复。

实施例5 ID1或ID3诱导的施万细胞促进坐骨神经损伤修复

坐骨神经损伤模型制作：选取8～12周，体重200g左右，SD雌鼠，以以1％水合氯醛腹腔注射麻醉(5ml/kg)，在股骨头上端附近分离坐骨神经后行全横断，并将两断端用硅胶导管进行缝合后连接，两断端距离为5mm。

应用实施例2中获得的对照成纤维细胞、ID1或ID3诱导的施万细胞以2×10

一半组织冰冻切片(10um厚度)，免疫荧光染色Tuj1，并检测移植的细胞与再生神经之间的关系，结果如图5B发现移植ID1或ID3诱导的施万细胞的坐骨神经中再生的神经束更多，且与移植的细胞之间的接触更为紧密。

取材损伤坐骨神经侧的腓肠肌，4％多聚甲醛固定72h后，脱水，石蜡包埋，4um切片，HE染色，检测腓肠肌的萎缩情况，结果如图5C，发现移植ID1或ID3诱导的施万细胞的腓肠肌萎缩较对照明显减轻。以上结果提示ID1或ID3诱导的施万细胞能明显促进坐骨神经损伤修复。

实施例6 ID1或ID3慢病毒载体促进耳朵损伤后局部神经修复和创伤愈合

耳朵创伤模型制作：选取8～12周，体重20g左右，C57雌鼠，以1％水合氯醛腹腔注射麻醉(5ml/kg)，用直径2mm的耳朵打孔器，在耳朵中央位置打孔，制作耳朵创伤模型。

应用实施例2中的Vector-mCherry、ID1-mCherry、ID3-mCherry慢病毒载体，按照体积20ul中含有1×10

取材35d创伤组织，4％多聚甲醛固定72h后，脱水，石蜡包埋，4um切片，免疫荧光染色Tuj1表达，结果如图6，发现ID1和ID3慢病毒移植能明显促进局部神经修复再生。