铜绿假单胞菌生物被膜耐药性分析及toLA、ndvB基因检测

摘要

目的:(1)了解临床分离的铜绿假单胞菌形成生物被膜的能力及形成生物被膜后的耐药性变化;(2)探讨tolA、ndvB两耐药基因在铜绿假单胞菌浮游菌和生物被膜菌的分布和表达，以期为生物被膜菌感染治疗策略提供新的研究方向。
　　方法:(1)收集临床分离的铜绿假单胞菌60株，Vitek-2全自动微生物分析系统鉴定菌种。采用微孔板构建生物被膜模型，甲醇固定、结晶紫染色后显微镜观察生物被膜镜下形态，筛选出生物被膜阳性的菌株。聚合酶连反应(PCR)检测所有试验菌株的tolA和ndvB基因，并对基因扩增产物进行测序和BLAST分析。(2)采用微量肉汤稀释法测定生物被膜菌和其浮游菌妥布霉素、庆大霉素和阿米卡星的MIC值，比较生物被膜菌MIC值较浮游菌MIC值的倍数变化。(3)实时荧光定量PCR检测生物被膜菌和浮游菌tolA和ndvB基因相对表达量，采用配对t检验对生物被膜组和浮游菌组tolA、ndvB基因表达水平进行差异显著性检验，P＜0.05具有统计学差异。
　　结果:(1)60株临床分离铜绿假单胞菌经结晶紫染色筛选出生物被膜阳性58株，阳性率97％;所有菌株tolA、ndvB基因扩增结果阳性，测序结果与GenBank上已公布基因序列比对同源性均≥99％。(2)生物被膜妥布霉素MIC提高1～1024倍，庆大霉素MIC提高0～＞1024倍，阿米卡星MIC提高1～＞256倍，其中妥布霉素、庆大霉素和阿米卡星分别有12、20和15株PA成膜前后因耐药严重均未测出确定MIC值。(3)生物被膜组ndvB基因的相对表达量较浮游菌组明显上升(P＜0.05)，生物被膜组tolA基因的相对表达量与浮游菌组差异无统计学差异（P=0.16）。
　　结论:(1)几乎所有临床分离的铜绿假单胞菌均具有形成生物被膜的能力。tolA和ndvB基因存在于所有铜绿假单胞菌，是铜绿假单胞菌全基因组序列的组成部分。(2)临床菌株形成生物被膜后高水平耐药，对氨基糖苷类抗生素的耐药水平可提高几倍至上千倍。(3)ndvB基因表达上调普遍存在于生物被膜菌，对生物被膜菌耐药性发挥着重要作用，有望成为抗菌药物作用的新靶点;tolA基因在被膜菌表达无变化，可能该耐药机制在被膜菌表达上调仅存在个别菌株，仍需要大样本检测证实。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

1 前言

2 铜绿假单胞菌生物被膜菌初筛及tolA、ndvB基因检测

2．1 实验材料

2．1．1 实验菌株

2．1．2 主要仪器与设备

2．1．3 主要试剂

2．1．4 各种培养基及试剂配制

2．2 实验方法

2．2．1 铜绿假单胞菌生物被膜菌初筛

2．2．2 tolA、ndvB基因检涸

2．3 结果

2．3．1 生物被膜菌初筛结果

2．3．2 基因检测及测序分析结果

2．4 讨论

3 氨基糖苷类抗生素对被膜菌与浮游菌的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)测定

3．1 实验材料

3．1．1 实验菌株

3．1．2 主要仪器与设备

3．1．3 主要试剂‘

3．1．4 抗生素贮存液配制

3．2 实验方法

3．2．1 浮游菌MIC测定

3．2．2 生物被膜菌MIC测定

3．3 结果

3．3．1 MIC测定结果

3．4 讨论

4 铜绿假单胞菌被膜菌与浮游菌tolA、ndvB基因表达检测

4．1 实验材料

4．1．1 实验菌株

4．1．2 主要仪器与设备

4．1．3 主要试剂

4．1．4 各种培养基及试剂配制

4．2 实验方法

4．2．1 生物被膜菌与浮游菌RNA提取

4．2．2 RNA完整性的检测

4．2．3 RNA纯度和浓度检测

4．2．4 cDNA合成

4．2．5 Real time-PCR扩增

4．2．6 统计分析

4．3 结果

4．3．1 RNA提取结果

4．3．2 tolA、ndvB基因mRNA表达量

4．4 讨论

5 结论

参考文献

综述 生物被膜研究进展

攻读学位期间主要的研究成果

致谢