HMGB1在膀胱尿路上皮癌中的表达及其对T24细胞株生物学行为影响的研究

摘要

背景:膀胱癌是泌尿生殖系统中的常见肿瘤，其中90％的组织学类型为膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BUC)。尽管经过了多年的深入研究和探索，但BUC发生发展的分子生物学机制仍不十分明朗。目前针对BUC的各种治疗手段仍不能让人完全满意，BUC患者的总体预后仍不容乐观。因此，深入研究探索BUC发生发展相关的分子生物学机制对于提高BUC的诊疗水平和改善BUC患者的预后具有十分重大的价值。
　　高迁移率族蛋白1(high-mobility group box1，HMGB1)是一种在真核生物的细胞中广泛表达且高度保守的非组蛋白核蛋白。近年来研究发现，HMGB1与肿瘤的无限增殖，抵抗凋亡，新生血管生成，浸润转移等生物学行为密切相关，在肿瘤的发生发展中起到了重要的作用。但目前国内外对于HMGB1在BUC中的表达研究较少，其对BUC生物学行为的影响及其在BUC发生发展中所起的作用还不清楚。
　　目的:(1)研究HMGB1在BUC组织及细胞株中的表达情况，分析HMGB1的表达和BUC临床病理因素之间的关系。(2)探索构建靶向HMGB1的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)表达载体并转染人BUC细胞株T24来特异性的沉默HMGB1基因的表达。(3)研究shRNA介导的RNA干扰对T24细胞HMGB1表达的影响及T24细胞生物学活性的变化。(4)初步研究HMGB1影响人BUC细胞生物学行为可能的下游作用机制。
　　方法:(1)收集30例BUC组织及其配对的癌旁组织，采用Western-blot和实时荧光定量-PCR(real-time polymerase chainreaction，Real-time PCR)分析BUC组织和细胞中HMGB1的表达水平，同时采用免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）检测HMGB1蛋白的表达程度和定位，分析其表达水平和BUC临床病理因素之间的关系。(2)探索构建靶向HMGB1基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体并采用脂质体lipofectamineTM2000转染T24细胞来特异性的沉默HMGB1的表达，采用Western-blot和Real-time PCR检测shRNA干扰序列对HMGB1表达的影响。(3)采用MTT法、流式细胞术、Transwell实验研究pGPU6/GFP/Neo-HMGB1 shRNA-539表达载体转染的T24细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和细胞周期的变化。(4)采用Western-blot和Real-time PCR检测HMGB1干扰序列转染T24细胞后核转录因子-κB(nuclear factor kappa B/p65，NF-κB/p65)和血管内皮细胞生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)的表达水平，同时采用间接免疫荧光法(indirectimmunofluorescence)和酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)来分别检测NF-κB/p65在细胞内的定位情况和活性变化。
　　结果:(1) HMGB1在BUC组织中高表达，其表达水平显著高于配对的癌旁组织;IHC结果显示HMGB1的阳性染色颗粒绝大部分位于细胞核，少部分位于细胞浆;结合患者的临床病理资料进行分析发现HMGB1的表达水平与患者的组织学分级和TNM分期呈正相关;同时，HMGB1在5637、BIU-87和T24细胞中的表达水平逐次升高，与BUC细胞的恶性程度相关。(2)实验成功的构建了特异性干扰HMGB1基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体并成功转染T24细胞;经检测3条shRNA均可以特异性的抑制HMGB1的表达，其中以HMGB1 shRNA-539抑制效率最高。(3)特异性的干扰HMGB1基因的表达能在体外抑制T24细胞增殖、迁移、侵袭能力并诱导细胞周期G0/G1期迟滞和细胞凋亡。(4) HMGB1干扰序列转染T24细胞后NF-κB/p65和VEGF-C的表达水平下调;同时NF-κB/p65的核转位减少活性降低。
　　结论:(1) HMGB1的表达水平在BUC组织和细胞中明显增高，且与BUC的组织学分级和TNM分期正相关，HMGB1可能与BUC的发生发展密切相关。(2)特异性的下调T24细胞HMGB1的表达可以显著抑制其增殖、迁移、侵袭能力并诱导细胞周期G0/G1期迟滞和细胞凋亡，HMGB1可以作为BUC基因治疗的一个潜在靶点。(3)特异性的下调T24细胞HMGB1基因的表达可以引起细胞中NF-κB/p65和VEGF-C的表达下调，进而抑制NF-κB/p65的活性和核转位，提示HMGB1对VEGF-C的调节可能是由NF-κB通路来实现的。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一章 HMGB1在膀胱尿路上皮癌中的表达及临床意义

1．1 材料与方法

1．1．1 研究标本的选择和收集

1．1．2 临床病理资料的收集

1．1．3 主要试剂和材料

1．1．4 主要仪器和设备

1．1．5 实验方法

1．2 实验结果

1．2．1 免疫组化检测HMGB1的表达及细胞内定位

1．2．2 Western-blot检测HMGB1蛋白在BUC及癌旁组织中的表达

1．2．3 Real-time PCR检测HMGB1蛋白在BUC及癌旁组织中的表达

1．2．4 HMGB1的表达与临床病理资料之间的关系

1．2．5 HMGB1在不同的人BUC细胞株中的表达

1．3 讨论

1．4 结论

第二章 针对HMGB1的特异性shRNA表达载体的构建、筛选和鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 主要试剂和材料

2．1．2 主要仪器和设备

2．1．3 实验方法

2．2 实验结果

2．2．1 shRNA转染效率的检测

2．2．2 HMGB1 shRNA对T24细胞HMGB1蛋白表达的影响

2．2．3 HMGB1 shRNA对T24细胞HMGB1 mRNA表达的影响

2．3 讨论

2．4 结论

第三章 shRNA干扰T24细胞HMGB1的表达对其生物学行为的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 主要试剂和材料

3．1．2 主要仪器和设备

3．1．3 实验方法

3．2 实验结果

3．2．1 HMGB1 shRNA转染对T24细胞增殖的影响

3．2．2 HMGB1 shRNA转染对T24细胞周期的影响

3．2．3 HMGB1 shRNA转染对T24细胞凋亡的影响

3．2．4 HMGB1 shRNA转染对T24细胞迁移和侵袭的影响

3．3 讨论

3．4 结论

第四章 shRNA干扰HMGB1表达后其下游信号通路的初步研究

4．1 材料与方法

4．1．1 主要试剂和材料

4．1．2 主要仪器和设备

4．1．3 实验方法

4．2 实验结果

4．2．1 HMGB1 shRNA转染对T24细胞NF-κB／p65及VEGF-C表达的影响

4．2．2 HMGB1 shRNA转染对T24细胞NF-κB／p65核定位的影响

4．2．3 HMGB1 shRNA转染对T24细胞NF-κB／p65活性的影响

4．3 讨论

4．4 结论

总结

参考文献

综述 高迁移率族蛋白1与肿瘤

攻读学位期间主要研究成果

致谢