载银介孔氧化硅新型纳米菌材料体外抗菌性能及生物相容性能的实验研究

摘要

第一部分载银介孔氧化硅新型纳米抗菌材料抗菌性能研究
　　背景:载银介孔氧化硅(Ag-MSN)材料生物相容性好，机械性能佳，具有载药潜力及可控缓释药物能力，可望成为良好的骨替代材料抗菌载药颗粒。
　　目的:本实验通过对该材料的体外抗菌性能及Ag+缓释特点进行研究，探讨其应用于填充慢性骨髓炎术后骨缺损的可行性。
　　方法:采用标准肉汤稀释法及OD600细菌生长曲线测定法检测不同浓度的Ag-MSN混悬液及MSN混悬液对于金葡菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌/脆弱拟杆菌和白色念珠球菌的体外抗菌效果。将Ag-MSN混悬液分别浸泡于50 ml模拟体液(simulated body fluid，SBF)中，于3h/6h/12h/1d/3d/7d/10d/14d采用火焰原子吸收光谱法检测Ag+浓度，绘制银离子释放曲线，检测材料的Ag+缓释特点。
　　结果:Ag-MSN对于金葡菌/铜绿假单胞菌/大肠杆菌/脆弱拟杆菌的最小抑菌浓度(MIC)均≤200μg/ml，而最小杀菌浓度(MBC)则分别为400/200/200/200μg/ml，中间浓度材料浸提液相对于对照组能显著抑制细菌生长;但材料对于真菌——白色念珠球菌无明显杀菌效果，在400μg/ml浓度下仅能抑制其生长;Ag-MSN各浓度组SBF浸泡液中的银离子总释放趋势基本一致，均于浸泡6小时后达到银离子释放的峰值，浸泡3d后银离子释放渐趋稳定，与浸泡14天内无明显差异400，200组在14天内均维持在银离子生物安全浓度与最小抑菌浓度MIC之间。
　　结论:载银介孔氧化硅(Ag-MSN)材料在体外对金黄色葡萄球菌/大肠杆菌/铜绿假单胞菌/脆弱拟杆菌有明显抗菌作用，对于白色念珠球菌有抑菌作用。其在SBF中具有良好的缓释效果，有望成为针对慢性骨髓炎的良好的新型骨替代材料抗菌载药颗粒。
　　第二部分载银介孔氧化硅新型纳米抗菌材料对于成骨样细胞增殖分化能力的影响
　　目的:检测不同浓度载银介孔氧化硅(Ag-MSN)及介孔氧化硅纳米颗粒浸提培养液的细胞毒性，及其对成骨样细胞增殖分化能力的影响，探讨其生物相容性及将来应用于填充慢性骨髓炎术后骨缺损的可行性。
　　方法:采用CCK8法检测不同浓度的Ag-MSN浸提培养液及MSN浸提培养液对于成骨样细胞的细胞毒性及对其增值能力的影响。分别于共培养1，3，7天时采用ELISA法检测与不同组别浸提培养液共培养后的成骨样细胞的碱性磷酸酶(ALP)，骨钙素(OC)的蛋白分泌量。实时定量PCR(qRT-PCR)法检测碱性磷酸酶(ALP)，骨钙素(OC)基因表达的变化。
　　结果:在检测的3个时间点下，4组不同浓度的Ag-MSN材料浸提液与MSN浸提液培养下的成骨样细胞生长良好，各实验组与对照组的细胞数目均随着培养时间的增加而增加，各实验组均未抑制成骨样细胞的增殖功能。细胞毒性CTS分级均为0-1级，未表现出明显的细胞毒性。成骨样细胞在不同浓度的Ag-MSN及MSN浸提培养液培养下与对照组的成骨样细胞一样，ALP活性随着培养时间的增加而增加，高浓度的Ag-MSN浸提培养液及MSN浸提培养液能提高ALP的基因表达和蛋白分泌量及OC基因的表达，与对照组有统计学差异(P＜0.05)，但对BGP蛋白分泌量则无明显影响(P＞0.05)。
　　结论:Ag-MSN与MSN均有较好的生物相容性，无细胞毒性。同时Ag-MSN与MSN浸提培养液均有一定的骨诱导作用。
　　第三部分载银介孔氧化硅新型纳米抗菌材料对于成骨样细胞OPG/RANKL通路的影响
　　目的:检测不同浓度载银介孔氧化硅(Ag-MSN)及介孔氧化硅纳米颗粒浸提培养液对成骨样细胞破骨细胞分化相关通路---OPG/RANKL通路的影响，在体外实验中从分子蛋白水平探讨材料是否会通过OPG/RANKL通路影响骨重建。
　　方法:采用不同浓度的Ag-MSN浸提培养液及MSN浸提培养液作为检测液体与成骨样细胞共培养。分别于共培养1，3，7天时采用实时定量PCR(qRT-PCR)法检测OPG, RANKL基因表达的变化。采用Western Blot法检测与不同组别浸提培养液共培养后的成骨样细胞细胞内的护骨素(OPG)与破骨细胞分化因子（RANKL）蛋白分泌量的变化趋势。
　　结果:qRT-PCR结果显示，各实验组与对照组的OPG基因表达量自第3天开始逐渐升高，其后一直维持在较高水平，各实验组与对照组间无统计学差异(P＞0.05)。而RANKL的基因表达量在共培养第7天著升高，对照组与各实验组均表现了这一特性，组间无统计学差异(P＞0.05)。Western Blot结果显示，共培养7天后，各实验组及对照组成骨样细胞中OPG蛋白量无明显差异，但实验组的RANKL蛋白表达量较对照组有轻度升高，其中高浓度的400μg/ml Ag-MSN组与400μ g/ml MSN组升高较为明显，有统计学差异。
　　结论:在体外共培养的早期，即成骨样细胞分化至成熟阶段，Ag-MSN与MSN对于成骨/破骨细胞间的OPG/RANKL通路无明显影响，但在成骨样细胞成熟期，高浓度的Ag-MSN及MSN会通过增加成骨细胞RANKL蛋白的表达进而轻度活化破骨细胞。但其是否在体内通过这一作用增加破骨细胞功能，对新生骨产生破坏骨质的副作用仍有待进一步的体内试验研究。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词简表

前言

第一章 载银介孔氧化硅新型纳米抗菌材料抗菌性能研究

1．1 材料设备与实验方法

1．1．1 仪器设备与试剂

1．1．2 标准菌株

1．1．3 材料的预处理

1．1．4 Ag-MSN对于骨髓炎常见致病菌MIC／MBC及生长曲线影响的检测

1．1．5 Ag-MSN在模拟体液中银离子释放曲线的检测

1．1．6 统计学方法

1．2 抗菌性能检测结果

1．2．1 标准肉汤稀释法检测材料对骨髓炎相关致病菌MIC／MBC及生长曲线的影响

1．2．2 Ag-MSN在模拟体液中银离子释放曲线的检测

1．3 讨论

1．4 本章小结

第二章 载银介孔氧化硅新型纳米抗菌材料对于成骨样细胞增殖分化能力的影响

2．1 主要材料与及实验方法

2．1．1 仪器与材料

2．1．2 人成骨样细胞的培养

2．1．3 材料浸提培养液的制备

2．1．4 不同浓度Ag-MSN及MSN培养基浸提液细胞毒性检测

2．1．5 不同浓度Ag-MSN及MSN培养基浸提液对于成骨样细胞分化能力相关指标的影响

2．1．6 统计学方法

2．2 实验结果

2．2．1 CCK8法检测材料的细胞毒性(MG63)

2．2．2 不同浓度Ag-MSN及MSN培养基浸提液对于成骨样细胞分化能力相关指标的影响检测结果

2．3 讨论

2．4 本章小结

第三章 载银介孔氧化硅新型纳米抗菌材料对于成骨样细胞OPG／RANKL通路的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 仪器与材料

3．1．2 人成骨样细胞的培养

3．1．3 材料浸提培养液的制备

3．1．4 不同浓度Ag-MSN及MSN培养基浸提液对于成骨样细胞OPG／RANKL通路关键因子基因及蛋白表达的影响

3．1．5 统计学方法

3．2 实验结果

3．2．1 Western Blot法检测各实验组及对照组成骨样细胞中OPG及RANKL蛋白量

3．2．2 qRT-PCR法检测各实验组及对照组成骨样细胞中OPG及RANKL基因表达量

3．3 讨论

3．4 本章小结

结论

参考文献

附录

综述 可生物降解和非生物降解抗生素释放载体在骨髓炎治疗中的应用

攻读学位期间主要的研究成果

致谢