miR302A-3p在高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用及分子机制

摘要

背景:糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）既是糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)的主要微血管病变之一，也是终末期肾病(End-stage renal disease，ESRD)的主要病因之一。糖尿病肾病强调早期诊断与治疗，如果不及时干预，将导致肾小球硬化及肾间质纤维化(Tubulointerstitial fibrosis，TIF)，最终发展为肾衰竭直至终末期肾病(End-stage renal disease，ESRD)。肾小管上皮细胞转分化(Epithelial tomesenchymal transition，EMT)不仅是TIF的始动环节，而且也是其可逆阶段，所以有关肾小管上皮细胞转分化的研究一直是肾纤维化防治的一个热点。最近发现有多种microRNA参与EMT过程，但机制尚不明确。miR-302a-3p是miR-302家族中的一员，我们经过miRNA基因芯片筛查发现miR-302a-3p在高糖刺激的HK-2细胞中表达上调，说明它可能参与高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化过程，但具体作用及其机制如何是我们需要探讨的问题。
　　目的:探讨miR-302a-3p在高糖诱导肾小管上皮细胞转分化的作用及其分子机制。
　　方法:(1) HK-2细胞分为两组，高糖刺激48h组与低糖组，用miRNA芯片筛查两组之间有差异性表达的miRNA;
　　(2)将HK-2细胞进行高糖刺激，用Realtime PCR来验证miR-302a-3p的表达差异，用Realtime PCR及Wenstern blot来检测高糖刺激0h、6h、12h、24h、48h、72h各个时间点的ZEB1、VIM、E-ca的表达;
　　(3)向HK-2细胞内转染miR-302a-3p的Mimic及Inhibitor，分为空白组、Mimic组、Mimic阴性对照组、Inhibitor组、Inhibitor阴性对照组，转染后高糖培养48小时，用Realtime PCR及Wensternblot来检测ZEB1、VIM、E-ca的表达。
　　结果:(1) microRNA芯片分析提示高糖刺激肾小管上皮细胞48小时后，miR302a-3p、513a-5p、1291等17个miRNA表达明显上调，而miRNA490-3p、638、3203等19个miRNA表达明显下调(p＜0.01)
　　(2)在HK-2细胞中，①miR-302a-3p在高糖刺激12h表达上调达高峰(P＜0.01)，ZEB1 mRNA表达先下降后升高，12h下降最明显(P＜0.01)，高糖诱导VIM mRNA表达呈时间依赖性增加，48h最明显(P＜0.05)，而E-ca mRNA表达呈时间依赖性降低，72h最明显(P＜0.01);②高糖刺激后，ZEB1蛋白表达先下降后升高，在24小时表达量最低(P＜0.01)，VIM蛋白的表达上调，72h上调最明显(P＜0.01);而E-ca蛋白表达下调，72h下调最明显(P＜0.01);
　　(3) Mimic组与Inhibitor组中，与空白组相比，ZEB1 mRNA差异无统计学意义(P＞0.05)，在Mimic组中，ZEB1蛋白表达下降(P＜0.01)，VIM mRNA及蛋白表达下降(P＜0.01)，而E-ca mRNA及蛋白表达上调(P＜0.05);在Inhibitor组中，ZEB1、VIM蛋白表达明显上调(P＜0.01)，VIM mRNA表达上调，但差异无统计学意义(P＞0.05)，而E-ca mRNA及蛋白表达下调(P＜0.05)。
　　结论:(1)在高糖状态下，过表达miR-302a-3p可逆转HK-2细胞转分化，而抑制miR-302a-3p表达可促进其转分化，且这一过程可能与ZEB1相关;
　　(2) miR-302a-3p可能通过ZEB1对高糖诱导的HK-2细胞转分化起保护作用。

目录

声明

摘要

英文注释

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞株

2．1．2 主要仪器与耗材

2．1．3 试剂

2．1．4 主要溶液的配置

2．2 实验方法

2．2．1 细胞的复苏和培养

2．2．2 细胞传代

2．2．3 细胞冻存

2．2．4 细胞高糖刺激后miRNA芯片筛查

2．2．5 细胞种板

2．2．6 细胞高糖刺激

2．2．7 细胞转染

2．2．8 实验分组

2．2．9 基因水平的检测

2．2．10 蛋白水平的检测

2．3 统计学分析

3 实验结果

3．1 高糖刺激HK-2细胞后miRNA表达谱的变化

3．2 高糖刺激HK-2细胞后miR302a-3p的表达变化

3．3 高糖刺激后对HK-2细胞ZEB1 mRNA及蛋白表达水平的影响

3．4 高糖刺激后对HK-2细胞VIM、E-ca mRNA及蛋白水平表达的影响

3．5 转染干预对HK-2细胞miR-302a-3p表达变化

3．6 转染干预对HK-2细胞ZEB1 mRNA及蛋白表达水平的影响

3．7 转染干预对HK-2细胞VIM、E-ca mRNA及蛋白表达水平的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

综述 microRNA在糖尿病肾病发病机制及治疗的研究进展

致谢