TALE酶介导的基因定点整合及原位修复研究

摘要

同源重组介导的基因定点整合以及原位修复是比较理想的基因编辑方式。但是由于细胞中内在的同源重组效率很低，所以这两种策略的应用在研究中还并不普及。类转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)的出现，可能会大幅度推进这类定点基因编辑技术的发展。本研究在以往研究的基础上，探讨TALENs以及我们自主设计改造的类转录激活因子样效应物切口酶(Transcription activator-like effector nickases，TALENickases)在促进细胞同源重组效率方面的作用。
　　第一章 TALE酶促进rDNA区定点整合研究
　　目的:探索TALENs和TALENickases促进多拷贝rDNA位点转基因定点整合的能力及其细胞毒性方面的区别，以评估TALE酶应用于rDNA区基因打靶的可行性。
　　方法:(1)为了在转染细胞后实时观察定点整合效率，我们构建了一个能够将无启动子GFP序列定点靶入rDNA区的基因打靶载体;(2)我们将该打靶载体联合TALENs或者TALENickases表达载体共转染HEK293T细胞，在不同的时间点通过流式细胞仪检测各组合的GFP阳性细胞比例;(3)另外单用TALENs或者TALENickases表达载体转染HEK293T细胞，转染后第三天通过AnnexinⅤ-FITC/PI复染的方式检测各自的细胞毒性;(4)在此基础上，我们使用携带外源基因F9的rDNA区打靶载体pHrnF9(插入片段为5.4kb)联合TALENs或者TALENickases共转染HT1080细胞，经G418筛选后挑取抗性克隆。通过PCR、Southern blot对抗性克隆进行鉴定。并通过RT-PCR、Elisa检测转基因的表达。
　　结果:(1) TALENs和TALENickases均能够刺激GFP在rDNA区的高效定点整合。但随着连续培养的进行，TALENs组的GFP阳性细胞比例会显著降低，而TALENickases组则不会像前者一样急剧变化;(2) AnnexinⅤ-FITC/PI复染的结果显示TALENs与TALENickases相比具有显著的高毒性特征;(3) HT1080细胞打靶结果显示TALENickases能够显著促进5.4kb片段的定点整合效率，最高达0.62％，转基因能够有效表达，而TALENs的促进作用不明显。该方法促进定点整合的转基因能够有效表达。
　　结论:对多拷贝的rDNA位点来说，TALENickases更适合用来促进转基因的定点整合。
　　第二章人凝血因子Ⅷ基因22号内含子倒位型iPSCs的原位修复研究
　　目的:建立一种针对人凝血因子Ⅷ基因(F8)22号内含子倒位型血友病A(hemophiliaA，HA)的基因原位修复策略，并在病人特异性诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)中进行验证。
　　方法:(1)收集22号内含子倒位型HA患者的尿液，分离培养其中的肾小管上皮细胞并将其诱导成iPSCs;(2)针对该类型HA构建含有原位修复插入序列的基因打靶质粒，同时设计针对修复位点的TALENs并验证切割活性;(3)使用原位修复载体联合TALENs对病人特异性iPSCs进行基因打靶，筛选抗性克隆，通过定点整合PCR、Southern blot进行鉴定;(4)获得确定打靶的克隆后，再将其消化成单个细胞并核转染pCAG-Cre。连续培养后挑取单细胞形成的克隆，通过PCR、Southern blot检测确定筛选基因PGK-Neo表达框已被完全切除;(5)将修复前的iPSCs以及原位修复并完全切除PGK-Neo表达框的克隆定向分化成内皮细胞，通过RT-PCR检测修复前后人凝血因子Ⅷ基因的表达情况。
　　结果:(1)成功建立了一株22号内含子倒位型的HA患者特异性iPSCs。该细胞株能够表达各种多能性标志蛋白，能够在小鼠体内通过形成畸胎瘤的方式分化成三胚层的组织，并保持正常二倍体核型;(2)构建了用于原位修复F8基因22号内含子倒位突变的基因打靶载体，并设计了对应的TALENs;(3)使用原位修复质粒联合TALENs对病人特异性iPSCs进行了成功的打靶;(4)并进一步通过瞬时表达环化重组酶(Cyclization recombinase，Cre)切除了PGK-Neo表达框;(5)将修复后的克隆定向分化成内皮细胞后，可检测到F8的正常转录。
　　结论:我们设计的原位修复策略可以在转录水平上纠正22号内含子倒位型F8的表达。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一章 TALE酶促进rDNA区定点整合研究

1．1 材料

1．1．1 引物

1．1．2 质粒

1．1．3 菌株、细胞

1．1．4 主要仪器设备

1．1．5 耗材、试剂

1．1．6 试剂配制

1．2 方法

1．2．1 质粒的制备

1．2．2 gDNA及RNA的手工提取

1．2．3 构建pHr5468-GFP

1．2．4 使用pHr5468-GFP打靶HEK293T

1．2．5 TALENs／TALENickases细胞毒性检测

1．2．6 pHrnF9打靶HT1080

1．2．7 PCR初步检测定点整合

1．2．8 Southern blot检测定点整合

1．2．9 F9 Elisa

1．3 结果

1．3．1 质粒的准备

1．3．2 pHr5468-GFP打靶HEK293T细胞

1．3．3 TALENs／TALENickases毒性检测

1．3．4 TALENs／TALENickases促进大片段的定点整合

1．3．5 定点整合后转基因的表达

1．4 讨论

1．5 结论

第二章 人凝血因子Ⅷ基因22号内含子倒位型iPSCs的原位修复研究

2．1 材料

2．1．1 引物

2．1．2 质粒

2．1．3 菌株、细胞、动物

2．1．4 主要仪器设备

2．1．5 耗材、试剂

2．1．6 试剂配制

2．2 方法

2．2．1 TALENs表达质粒的构建

2．2．2 原位修复质粒F8-22-PGK-Neo的构建

2．2．3 TALENs切割活性检测

2．2．4 尿液标本的采集

2．2．5 尿液细胞的培养及iPS细胞的诱导

2．2．6 MEF的准备

2．2．7 iPS细胞的培养及鉴定

2．2．8 F8-22-PGK-Neo打靶F8基因22号内含子倒位型iPSCs

2．2．9 切除PGK-Neo表达框

2．2．10 F8-22-PGK-Neo打靶的鉴定

2．2．11 切除PGK-Neo鉴定

2．2．12 iPS细胞向内皮细胞的定向分化

2．2．13 CD31磁珠分选分化的内皮细胞

2．2．14 RT-PCR检测F8的表达

2．3 结果

2．3．1 TALENs表达质粒的构建

2．3．2 原位修复质粒F8-22-PGK-Neo的构建

2．3．3 TALENs切割活性检测

2．3．4 尿液细胞的培养及iPSCs的诱导

2．3．5 iPSC克隆干细胞特性检测

2．3．6 F8-22-PGK-Neo打靶F8基因22号内含子倒位型iPSCs

2．3．7 切除PGK-Neo表达框

2．3．8 原位修复前后的iPSCs向内皮细胞的分化

2．3．9 原位修复后F8的表达

2．4 讨论

2．5 结论

参考文献

附录

综述 ZFNs与TALENs研究进展

个人简介

致谢