EGCG抑制人胃腺癌SGC-7901细胞裸鼠移植瘤生长及新生血管形成实验研究

摘要

目的:
　　观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人胃腺癌细胞(SGC-7901)裸鼠移植瘤生长及新生血管形成的抑制作用,并探讨其分子机制。
　　方法:
　　1. EGCG对体外培养人胃腺癌SGC-7901细胞增殖的影响:采用MTT比色法求EGCGIC50值、绘制细胞生长曲线、求群体倍增时间并检测细胞活力,观察 EGCG对SGC-7901细胞的生长抑制作用。
　　2.人胃腺癌SGC-7901细胞裸鼠异种移植瘤模型的建立和分组:BALB/C裸小鼠分别于背侧靠腋窝皮下接种0.2ml/只(相当于2×106个细胞)。30只实验裸鼠分为6组,即生理盐水对照组、5-氟尿嘧啶阳性药对照组、米诺环素(Minocycline)血管形成抑制剂阳性药对照组、5mg/kg浓度EGCG组、10mg/kg浓度EGCG组、20mg/kg浓度EGCG组。成瘤后,生理盐水对照组隔日腹腔注射生理盐水,其余各组隔日腹腔给药。
　　3.评价EGCG治疗人胃癌的有效性:绘制裸鼠异种移植瘤体积生长曲线,处死裸鼠后称瘤重,计算抑瘤率;Western blot检测不同浓度EGCG及阳性对照药对移植瘤组织细胞核转录因子NF-KB(P65)蛋白表达的影响;间接免疫荧光标记流式细胞术检测移植瘤血管内皮生长因子(VEGF)荧光峰值的表达情况;酶联免疫吸附技术(ELISA法)检测各组裸鼠血清中VEGF的浓度;采用免疫组化SP法对移植瘤中VEGF、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表达进行检测及计数CD34标记的微血管密度。
　　结果:
　　1.在体外抗癌细胞增殖实验中,EGCG对人胃腺癌SGC-7901细胞MTT比色结果显示EGCG能呈浓度依赖性抑制SGC-7901细胞增殖,不同浓度EGCG(20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml)处理SGC-7901细胞48h后,其细胞增殖抑制率分别为21.7％、32.8%、52.5%、61.3%、66.5%,与空白对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。IC50为58.60μg/ml。
　　2. EGCG浓度从20μg/ml增加到100μg/ml时,细胞群体倍增时间由34.50h延长到94.74 h(P<0.05);细胞活力检测结果显示,生理盐水组与 EGCG各浓度处理组细胞存活率差异无显著性(P﹥0.05)。
　　3.成功建立人胃腺癌细胞裸鼠异种移植瘤模型。EGCG作用20天5mg/kg组平均瘤重1.094克,平均抑瘤率为34.51%,与生理盐水组差异有显著性意义(P<0.05);10mg/kg组平均瘤重0.905克,平均抑瘤率为45.81%;20mg/kg组平均瘤重0.758克,平均抑瘤率为54.64%,与生理盐水组差异均有显著性意义(P<0.01)。
　　4.Western blot分析表明:核转录因子NF-KB(P65)蛋白表达随EGCG浓度的升高而降低,呈浓度依赖性。
　　5.间接免疫荧光标记的流式结果显示:EGCG5mg/kg组对间接免疫荧光标记VEGF荧光峰值的表达与生理盐水组差异无明显作用(P﹥0.05);EGCG10mg/kg组、20mg/kg组VEGF荧光峰值的表达有浓度依赖性抑制作用,与生理盐水组差异有显著性意义(P<0.05)。
　　6.酶联免疫吸附实验结果显示:EGCG5mg/kg组,血清VEGF浓度与生理盐水组比无明显差异(P>0.05);EGCG10mg/kg组,20mg/kg组血清VEGF浓度低于生理盐水组,有统计学意义(P<0.05)。
　　7.免疫组化结果显示:生理盐水对照组VEGF和MMP-2蛋白的高表达率与各浓度 EGCG组两种蛋白的表达率降低比较,两者差异有显著性意义(P<0.05);CD34标记的微血管密度与血管浸润的强度有关,各组微血管计数结果 EGCF20mg/kg组最少。
　　结论:
　　1.EGCG对体外培养的人胃腺癌SGC-7901细胞具有抑制增殖作用,呈浓度依赖性;
　　2.EGCG可抑制人胃腺癌SGC-7901细胞裸鼠异种移植瘤的生长;
　　3.EGCG可能通过抑制VEGF和MMP-2的表达而抑制移植瘤血管的形成。

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英文摘要

目录

前言

材料与方法

一` 实验材料

(一) 细胞

(二) 实验动物

（三）主要试剂与配制

（四）主要仪器

二、实验方法

第一部分 EGCG体外对人胃腺癌SGC-7901细胞生长抑制作用的研究

第二部分 EGCG对裸鼠体内人胃腺癌SGC-7901细胞抑制新生血管形成的实验性研究

结果

第一部分 EGCG体外对人胃腺癌SGC-7901细胞生长抑制作用的研究

一. MTT比色法测定EGCG对SGC-7901细胞增殖的影响

二. EGCG对SGC-7901细胞生长的影响

第二部分 EGCG对裸鼠体内人胃腺癌SGC-7901细胞抑制新生血管形成的实验性研究

一、裸鼠生长及成瘤情况

二、EGCG对移植瘤的生长抑制作用

三、EGCG处理后移植瘤的形态学改变

四、EGCG对荷瘤鼠体内的毒性作用

五. Western blot分析不同浓度EGCG组对细胞核转录因子NF-KB（P65）表达的变化。

六. EGCG对人胃癌细胞裸鼠移植瘤血管内皮生长因子（VEGF）的抑制作用。

七. 酶联免疫吸附实验检测人胃癌细胞裸鼠移植瘤模型裸鼠血清中VEGF的浓度

八．EGCG对人胃癌裸鼠移植瘤模型血管内皮生长因子及基质金属蛋白酶-2阳性判定

九.EGCG对人胃癌裸鼠移植瘤模型微血管密度阳性判定

讨论

结论

参考文献

综述

硕士期间的成果

主要英文缩略语

致谢