大熊猫犬冠状病毒S基因的扩增、克隆和序列分析

摘要

该研究是在完成大熊猫肝脏分离病毒的鉴定的基础之上,对CCVDXMV的S基因其它部分进行基因扩增、克隆和序列测定,并与其它CCV株的S基因序列进行同源性分析.犬冠状病毒只有一个血清型,但不同地区和动物来源的毒株在毒力和分子生物学方面不尽相同.病毒基因的克隆和序列测定是分析病毒遗传特征的最佳方法.该研究以测定该株CCV的S基因序列为主要研究内容,目的在于研究其分子生物学特征,探讨其S基因与其它株的差异,从而为犬冠状病毒病的基因工程疫苗研究提供科学依据,也为大熊猫的病毒性疾病的防治奠定基础.由于CCV的S基因很大,一次扩增整个基因的难度很大.该株病毒是新分离的CCV毒株,病毒滴度低,增加了RT-PCR的难度.所以该实验设计了半套式PCR引物分段扩增S基因.根据GeneBank中发表的CCV K378株基因序列,利用软件Primer Premier5.0共设计了六条引物(SF<,2>-SR<,2>,SF<,3>-SR<,3>,SRI<,3>,SFI<,3>),其中SF<,2>-SR<,2>扩增出了792bp的基因片段;SF<,3>-SR<,3>为外层的半套式引物,SRI<,3>、SFI<,3>分别为内层的半套式引物,分别扩增出了737bp和1178bp的基因片段.同时根据CCVInsavc-1株基因序列设计了引物SF<,1>-SR<,1>,SF<,4>-SR<,4>和SFI<,4>.SF<,1>-SR<,1>扩增368bp的片段,SF<,4>-SR<,4>和SFI<,4>用于套式扩增985bp的基因片段.将各部分的PCR产物纯化,并分别克隆入pGEM-T载体中,用PCR和限制酶酶切两种方法鉴定重组质粒,然后将阳性重组菌送生物公司测序.5个S基因片段合并起来囊括了S基因的81-1166位以外的全部序列,序列用生物软件编辑除去各部分重复序列和引物序列,得到S基因的全部序列.将CCV DXMV的S基因序列和其它CCV毒株、TGEV HN2002和FIPV 79-1146的S基因序列用DNAstar和DNAsis作多重比较,并绘制了进化树.核苷酸序列分析比较表明,该病毒与CCV NVSL和K378株的同源性最高,可达到99.5％;而与CCV 23/03的同源性最低,为56.9％;与FIPV和TGEV分别有90.4％和82.1％的同源性.DXMV与K378、CCV6、CCV V54、FIPV79-1146、TGEV HN2002和CCV23/03的氨基酸序列同源性分别为:99.0％、97.1％、96.1％、92.7％、81.3％和50.0％.该研究对大熊猫分离的犬冠状病毒的部分S基因进行了克隆和序列分析,为大熊猫的疾病防治工作提供了必要的信息和资料,同时也丰富了犬冠状病毒的分子生物学研究内容.

目录

文摘

英文文摘

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前言

正文

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 PCR扩增结果

2.2重组质粒的PCR和酶切鉴定结果

2.3序列测定及序列分析结果

3讨论

3.1关于病毒的RNA的提取

3.2关于套式PCR(n-PCR)

3.3关于基因的克隆

3.4关于序列分析

结论

参考文献

附图1 大熊猫分离病毒与CCV其它毒株氨基酸序列比较结果

附图2 大熊猫分离毒与CC其它毒株核苷酸序列多重比较图

致谢

附录一

附录二

附录三

附录四

附录五

附录六

附录七