犬冠状病毒大熊猫株核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达

摘要

首次对犬冠状病毒大熊猫株(CCV GP)核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定.本实验根据GenBank中报道的CCV lnsavc-1株N蛋白基因序列,设计了一对特异性引物, 对分离的CCV GP野毒株进行了RT-PCR扩增.将扩增的PCR产物纯化回收后与pGEM-T连接得到重组质粒pTN, 进行核苷酸序列测定.结果该基因全长1 146 bp, 编码382个氨基酸; 与CCⅤ标准毒株Insavc-l N基因相比, 核苷酸的同源性为92.6%, 推导的氨基酸的同源性为93.2%.在推导的N蛋白N端156-179位存在一个SRXX富集区, 与小鼠肝炎病毒N蛋白相应区域相同, 推测可能是RNA结合区.预测的GP株N蛋白疏水性和抗原表位与Insavc-l株N蛋白存在细微的差异.将pTN双酶切, 回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET28 a中构建了重组质粒pETN, 转化大肠杆茵BL21, 用IPTG进行了诱导表达.结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为48 KD的重组蛋白, 免疫印迹法证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性反应.经凝胶薄层扫描分析, 重组N蛋白表达量可占菌体蛋白的49.3%,表达的蛋白纯化后可用于建立检测大熊猫CCV抗体间接ELISA用的包被抗原.