生长抑素与奥沙利铂对HepG2增殖和凋亡及survivin、fas、TNF-a表达的影响

摘要

目的：通过应用MTT、DAPI、DNA-Ladder法检测生长抑素与奥沙利铂的联合干预对体外培养人肝细胞肝癌株HepG2增殖与凋亡的影响，以及应用RT-PCR、Western Blot法检测细胞模型药物干预前后survivin、fas、TNF-a的基因和蛋白表达的变化。从而探讨其药物联合作用的机理，为临床肝癌的发病机制与治疗提供实验依据。
　　方法：用HepG2建立细胞模型，按照医学统计学进行随机实验分组，对照组分3小组，实验组分5小组，每小组平行设计6例，共计48例。以0小时，0浓度作为空白对照组，分别以生长抑素1250 ng/L、奥沙利铂5mg/L作为单独药物干预对照组，用生长抑素（125ng/L、1250ng/L、2500ng/L）分别作用于人肝细胞肝癌株（HepG2）24h后再予以奥沙利铂(1mg/L、5mg/L、10mg/L)作用于人肝细胞肝癌株24h、48h、72h作为实验组，具体方案见表1。采用MTT、DAPI检测细胞增殖和凋亡；用DNA Ladder检测核小体间断裂情况；用RT-PCR、Western Blot检测survivin、fas、TNF-a基因和蛋白的表达情况。采用SPSS13.0统计软件分析，P＜0.05有统计学意义。
　　结果：（1）生长抑素与奥沙利铂联合作用人肝细胞肝癌株HepG2在倒置位相显微镜下观察可见细胞生长受到抑制，并随着浓度的增高与时间的推移，凋亡细胞逐步增多；（2）MTT显示细胞存活率在生长抑素与奥沙利铂联合作用实验组比空白对照组和单独生长抑素组及单独奥沙利铂组明显减少（P＜0.05）；（3）DAPI显示细胞核裂解逐步加剧，早期显示细胞核膨胀，变形，晚期出现细胞裂解，凋亡小体形成。（4）DNA Ladder显示凋亡梯带形成，其中以生长抑素与奥沙利铂联合作用实验组凋亡梯带明显增多。（5）RT-PCR电泳显示凋亡抑制因子survivin mRNA逐步减少，凋亡因子fas mRNA与肿瘤坏死因子TNF-a mRNA逐步增多（P＜0.05）；（6）Westorn Blot电泳显示凋亡抑制因子survivin蛋白逐步减少，凋亡因子fas与肿瘤坏死因子TNF-a蛋白逐步增多（P＜0.05）。与对照组比较，生长抑素与奥沙利铂联合作用能减弱survivin mRNA和蛋白的表达，增强fas与TNF-a mRNA和蛋白的表达。
　　结论：(1)Survivin，fas，TNF-a可能介导了肝癌凋亡的发生。(2)生长抑素与奥沙利铂能使肝癌细胞增殖减慢，能诱导肝癌细胞凋亡。(3)生长抑素与奥沙利铂联合作用可显著诱导人肝癌细胞的凋亡，该作用可能是与下调 survivin mRNA和蛋白，上调fas、TNF-a mRNA和蛋白表达有关。Survivin作为fas、TNF-a的上游作用元件是否起到了启动子的作用，有待下一步继续研究。

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第一章 前 言

第二章 材料与方法

第一部分 人肝癌细胞HepG2的培养与药物干预

第二部分 DAPI检测凋亡

第三部分 MTT检测增殖

第四部分 DNA Ladder检测凋亡梯带

第五部分 survivin、fas、TNF-a mRNA检测

第六部分 survivin、fas、TNF-a蛋白检测

第三章 结 果

附图

第四章 讨 论

第五章 结 论

参考文献

综 述

参考文献

致谢