梅毒螺旋体TP 0993重组蛋白的表达、纯化及免疫活性研究

摘要

目的:构建含梅毒螺旋体(Treponema pallidum, TP)外膜蛋白TP0993的重组表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,纯化表达产物并进行免疫原性和抗原性分析,为探索TP0993重组蛋白在梅毒血清学诊断中的应用价值和其生物学功能提供实验依据。
　　方法:通过Genbank获取选TP0993基因序列,以TP Nichols株基因组DNA为模板,PCR扩增目的片段,将其亚克隆至原核表达载体 pET28a(+)中构建重组质粒pET28a(+)/TP0993,pET28a(+)/TP0993经PCR、双酶切、测序鉴定后将其转化至表达宿主菌E.coli Rosseta中,IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE和Western-blot分析和鉴定表达产物;Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,BCA法测定蛋白浓度。用纯化的TP0993重组蛋白包被微孔板,建立间接ELISA方法,检测临床梅毒患者血清和健康体检正常血清,同时与TPPA法进行比较,根据重组蛋白与梅毒阴阳性血清的反应情况,评价重组抗原在梅毒血清学诊断中的应用价值。同时用纯化的TP0993重组蛋白免疫新西兰兔,间接ELISA方法检测免疫兔血清中TP0993多克隆抗体的效价,对TP0993重组蛋白的免疫原性进行分析。
　　结果:通过Genbank获取选TP0993全基因序列;PCR扩增得到其目的片段;构建的重组质粒经酶切和测序鉴定证实插入片段为目的基因;SDS-PAGE结果显示,在IPTG诱导下,重组表达菌分别表达了一相对分子量(Mr)约为34KDa的重组蛋白,目的蛋白在菌体细胞内主要以包涵体形式存在,经 Ni-NTA亲和纯化后,纯度在85％以上;以重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA法;对TPPA法检测的480份阴阳性血清进行检测,与TPPA法比较ELISA法的灵敏度为88.3%,特异度为85.8%,ELISA法与TPPA法符合率为86.5%;利用纯化的TP0993重组蛋白免疫新西兰兔,间接ELISA法测定兔免疫血清特异性抗体效价在1:640以上。
　　结论:
　　1、成功构建了pET28a(+)/TP0993原核表达体,并能在大肠杆菌中表达出 TP0993重组蛋白。
　　2、TP0993重组蛋白能刺激新西兰兔产生较高效价的特异性抗体,具有较好的免疫原性。
　　3、TP0993重组蛋白能与梅毒阳性血清特异性结合,具有良好的抗原性,可应用于梅毒血清学诊断。

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前言

实验材料

1 实验菌株和表达载体

2 主要实验试剂

3 仪器设备

实验方法

1 生物信息软件分析与筛选

2. TP 0993基因抗原表位的扩增

3 pET28a（+）/TP 0993原核表达载体的构建及鉴定

4 TP 0993重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达与鉴定

5 TP 0993重组蛋白纯化与复性

6. TP 0993重组蛋白免疫活性评价

7.统计学方法

实验结果

1.TP 0993基因的PCR扩增

2. pET28a（+）/TP 0993原核表达重组质粒的构建及鉴定

3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达和鉴定

4 TP 0993重组蛋白的纯化

5. TP 0993重组蛋白免疫活性分析

讨论

结论

参考文献

[文献综述]

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