ABCA1介导载脂蛋白A1调节巨噬细胞炎症反应及其机制

摘要

动脉粥样硬化（atherosclerosis, As）相关心脑血管疾病的发病率和死亡率正逐年升高，其防治成为当前医学研究领域的重要课题。As的发病过程十分复杂，近年来，As是一种炎症疾病的观点越来越受研究者所重视，血管壁炎症反应被认为是As发生发展的关键因素。载脂蛋白A1（apolipoprotein A-I, apoA-I）是血浆高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）的主要成分，参与体内胆固醇逆向转运（reverse cholesterol transport, RCT），因此具有抗As的作用。近来研究发现，HDL/apoA-I除了参与RCT外，还具有显著的抗炎效应，其机制研究对于明确As的慢性炎症疾病特点及其防治具有重要意义。
　　三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)是以ATP为能源，促进细胞内游离胆固醇（free cholesterol，FC）和磷脂流出并转运至贫脂apoA-I，从而调节细胞内胆固醇平衡的一种整合膜蛋白。研究显示，ABCA1基因敲除（ABCA1-KO）鼠相对于野生鼠，除了在 As斑块中有更严重的脂质蓄积外还存在更多的炎症细胞浸润。而且，敲除或干扰ABCA1基因表达后HDL/apoA-I调节巨噬细胞炎症反应的效应明显消失或降低，提示ABCA1主要介导了 HDL/apoA-I的抗炎效应。前期研究显示，apoA-I/ABCA1的结合具有类似于配体/受体结合的高饱和性和亲和性。当apoA-I与ABCA1结合后可迅速激活巨噬细胞内多条信号途径，例如双面神激酶2（Janus kinase2，JAK2），环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和Rho家族小G蛋白CDC42等。活化JAK2通常进一步激活信号传导与转录激活因子（signal transducers and activators of transcription，STATs)家族蛋白，而JAK2/STATs信号途径是介导细胞外信号转导至细胞核，从而调节相关基因表达的重要信号转导途径。在巨噬细胞中，JAK2/STAT3信号途径被证实具有重要的抗炎作用，过表达STAT3或IL-10均可通过激活STAT3而抑制巨噬细胞多种炎症因子的表达。
　　生物信息学分析结果显示，ABCA1蛋白质胞内环的核苷酸结合结构域（nucleotide-binding domain，NBD）存在2个STAT3的激活位点 YXXQ基序（924-927和1990-1993），提示apoA-I与ABCA1结合后可能迅速激活巨噬细胞JAK2/STAT3信号途径。因此，本研究从apoA-I/ABCA1特殊的配体/受体结合功能入手，观察 HDL及其主要成分 apoA-I对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导巨噬细胞炎症反应的影响，探讨ABCA1介导apoA-I调节巨噬细胞炎症反应的胞内信号途径及其分子机制，并在体内明确apoA-I抗As炎症激活的效应及其作用机制。
　　第一部分apoA1对LPS诱导巨噬细胞炎症反应的影响及调节方式
　　目的：观察HDL及其不同成分对LPS诱导巨噬细胞源性泡沫细胞炎症因子表达的影响，并观察apoA-I调节巨噬细胞炎症反应的作用方式。
　　方法：培养THP-1细胞株，用160nmol/L的佛波酯（phorbol12-myristate13-acetate，PMA）刺激细胞12h，使其诱导分化为巨噬细胞，并以50mg/L的氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）孵育细胞使其转化为THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞。以 HDL（30μg/ml）及其主要成分 apoA-I（10μg/ml）、载脂蛋白B（apolipoprotein B，apoB）（10μg/ml）、卵磷脂（phosphatidyl-choline,PC）（25μg/ml）和胆固醇（cholesterol, CHO）（50ng/ml）分别预处理细胞3h后，用LPS（10ng/ml）处理细胞6h，采用免疫印迹实验(western blotting)和酶联免疫吸附法（ELISA）法检测肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα, TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin-1β, IL-1β）、单核细胞趋化因子1（monocyte chemotactic factor, MCP-1）、干扰素γ（interferon-γ,IFN-γ）、IL-6和环氧合酶2（cyclooxygenase-2, COX-2）的表达。提取人外周血单核细胞并诱导分化为巨噬细胞，oxLDL（50mg/L）孵育过夜后用apoA-I（10μg/ml）和/或LPS（10ng/ml）处理细胞。构建含 TNF-α启动子的氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase, CAT）报告基因，转染THP-1细胞，采用ELISA法观察apoA-I对LPS诱导TNF-α转录活性的影响；采用Western-blotting观察apoA-I对LPS诱导THP-1巨噬细胞IkBα磷酸化（p-IkBα）和核内p65 NF-kB表达的影响；不同处理因素处理细胞3h，加入放线菌素D（actinomycin D, Act D）终止转录，采用定量PCR检测巨噬细胞TNF-α等多种炎症因子mRNA的表达。
　　结果：HDL和 apoA-I预处理 THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞3h后，LPS诱导的炎症因子TNF-α、IL-1β、MCP-1、IFN-γ和IL-6的表达明显减少，COX-2的表达无明显变化；HDL的其他成分apoB、PC和CHO对LPS诱导的THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞炎症因子表达无明显影响。ApoA-I预处理人外周血巨噬细胞3h后显著降低LPS诱导的TNF-α的表达。apoA-I并不明显影响LPS诱导THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的TNF-α启动子活性、p-IkBα和核内p65 NF-kB表达的水平。Act D终止转录后，apoA-I预处理明显降低不同时间点LPS诱导的炎症因子TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6的mRNA表达量，提示其促进了炎症因子的mRNA降解。
　　结论：①apoA-I抑制LPS诱导的巨噬细胞多种炎症因子的表达；②apoA-I主要通过转录后调节炎症因子mRNA稳定性抑制LPS诱导的炎症因子表达。
　　第二部分 apoA-I抑制LPS诱导巨噬细胞炎症反应的分子机制
　　目的：探讨apoA-I抑制LPS诱导巨噬细胞炎症反应的细胞内分子机制。
　　方法：培养 THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型和人外周血巨噬细胞。以apoA-I和/或LPS处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞或人外周血巨噬细胞，采用Western-blotting和/或免疫荧光细胞化学等方法检测锌指蛋白36（Tristetraprolin，TTP）、人抗原R（Human antigen R，HuR）、磷酸化JAK2和STATs的表达。分别使用JAK2/STAT3信号途径抑制剂AG490，STAT3、ABCA1和TTP小RNA干扰（siRNA）处理细胞，以实时定量PCR、ELISA等方法分别检测巨噬细胞炎症因子mRNA和蛋白质的表达。采用RNA-EMSA法检测蛋白质是否与TNF-α3`非翻译区（3`-untranslated regions，3`-UTR）AU重复序列（AU-rich elements，ARE）形成蛋白质-RNA复合物。
　　结果：apoA-I明显上调LPS刺激下THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞和人外周血巨噬细胞TTP的表达，对HuR的表达没有明显影响；TTP siRNA下调THP-1巨噬细胞TTP的表达，并明显抑制apoA-I下调炎症因子表达和促进炎症因子mRNA降解的作用。RNA-EMSA结果显示，apoA-I促进THP-1巨噬细胞内蛋白质与ARE探针形成复合物，加入TTP抗体形成supershift带。ApoA-I迅速促进THP-1巨噬细胞JAK2和STAT3磷酸化，核内STAT3表达增加，STAT1和STAT6的磷酸化不受影响；AG490和STAT3 siRNA抑制JAK2、STAT3磷酸化，并明显抑制apoA-I对TTP表达的上调作用。ABCA1 siRNA下调ABCA1的表达，并明显抑制apoA-I对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞STAT3磷酸化和TTP表达的上调作用，也抑制了apoA-I促进TNF-αmRNA降解的效应。
　　结论：①apoA-I/ABCA1通过JAK2/STAT3信号途径上调LPS刺激下人巨噬细胞源性泡沫细胞TTP的表达；②apoA-I通过TTP促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞炎症因子mRNA的降解。
　　第三部分 apoA-I对apoE-/-小鼠血管壁炎症反应及As病变的影响及机制
　　目的：以apoE基因敲除（apoE-KO）小鼠为研究对象，观察过表达人apoA-I对LPS诱导apoE-KO小鼠动脉粥样硬化（As）病变、血管壁巨噬细胞浸润和炎症因子表达的影响，并在体内探讨其相关分子机制。
　　方法：20周龄雄性apoE-KO小鼠以普通饲料饲养，并随机分为四组：对照组、LPS组、LPS+apoAⅠ过表达组和LPS+GFP过表达组（每组20只）。其中，对照组每天皮下注射与实验组同等剂量的生理盐水；LPS组每天皮下注射 LPS（25μg/只）；LPS+apoAⅠ过表达组除给予LPS处理外，通过尾静脉注射2型腺相关病毒 rAAV2-apoAⅠ-GFP（1×1011v.p./只）；LPS+GFP过表达组除给以 LPS处理外，通过尾静脉注射2型腺相关病毒rAAV2-GFP（1×1011v.p./只）。4周后处死动物，采用肝脏组织荧光检测、荧光定量PCR法和Western-blotting法检测肝脏中人apoA-I mRNA和蛋白质表达水平；免疫比浊法检测血清中人apoA-I的表达水平。采用酶氧化法检测甘油三酯、总胆固醇等血脂水平；ELISA法检测血清炎症因子（TNF-α、IL-1β和MCP-1等）的表达；HE染色法观察主动脉窦动脉粥样硬化病变情况；油红 O染色观察主动脉和主动脉窦处脂质蓄积情况；免疫组织化学法检测巨噬细胞标志物 CD68的表达；荧光定量 PCR和/或 Western-blotting法检测小鼠主动脉ABCA1、TTP、p-JAK2和p-STAT3 mRNA和/或蛋白质的表达。提取小鼠腹腔巨噬细胞，检测TTP和炎症因子mRNA的降解情况。
　　结果：肝脏组织荧光检测结果显示，rAAV2注射后4周仍可检测到 GFP表达；荧光定量PCR和Western-blotting法结果显示，apoA-Ⅰ过表达组小鼠肝脏中人apoA-Ⅰ的mRNA和蛋白质水平明显升高；免疫比浊法显示apoA-Ⅰ过表达组小鼠血清中存在人apoA-Ⅰ的表达，而GFP过表达组未检测到人apoA-Ⅰ。与对照组比较，LPS组小鼠血浆HDL水平降低，其他脂质成分无明显改变，但TNF-α、IL-1β和MCP-1等炎症因子的水平明显升高，主动脉窦处As病变面积增大，主动脉和主动脉窦部脂质含量增加，主动脉炎症因子水平明显升高，主动脉窦部炎症细胞浸润明显；与LPS组小鼠比较，LPS+apoA-Ⅰ过表达组小鼠的HDL-胆固醇和总胆固醇明显增加，血浆炎症因子的水平明显降低，主动脉窦处As病变明显减轻，主动脉和主动脉窦部脂质含量明显减少，主动脉炎症因子水平明显降低，主动脉窦部巨噬细胞浸润明显减少，主动脉ABCA1、p-JAK2、p-STAT3和TTP的表达明显增加。相对于LPS组，LPS+ apoA-Ⅰ过表达组小鼠腹腔巨噬细胞 TTP的表达明显增加，TNF-α和 IL-1β的mRNA降解率增快。相对于 LPS组，LPS+GFP过表达组小鼠上述指标无明显变化。
　　结论：①过表达人apoA-Ⅰ抑制LPS诱导apoE-KO小鼠As病变的发展；②apoA-Ⅰ降低LPS处理apoE-KO小鼠炎症因子水平，并抑制斑块内巨噬细胞浸润；③apoA-Ⅰ上调apoE-KO小鼠主动脉和腹腔巨噬细胞TTP的表达，并促进炎症因子mRNA降解，该效应与激活JAK2/STAT3途径和上调ABCA1有关。

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主要缩略语中英文索引

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第一部分 apoA-I对LPS诱导巨噬细胞炎症反应的影响及其调节方式

前言

1.实验材料

2．实验方法

3. 实验结果

讨论

小结

第二部分 apoA-I抑制LPS诱导巨噬细胞炎症反应的分子机制研究

前言

1.实验材料

2．实验方法

3. 实验结果

讨论

小结

第三部分 apoA-Ⅰ对apoE-/-小鼠血管壁炎症反应及As病变的影响及机制

前言

1. 实验材料

2. 实验方法

3. 实验结果

讨论

小结

结论

参考文献

综述

攻读学位期间所获科研成果

课 题 资 助

致谢