靶向Survivin的siRNA对鼻咽癌细胞生长抑制作用的研究

摘要

本文对靶向Survivin的siRNA对鼻咽癌细胞生长抑制作用进行了研究。本研究分为两个部分：
　　第一部分：
　　目的：通过构建靶向Survivin的shRNA真核表达载体的方法来探讨RNAi技术对鼻咽癌细胞生长抑制作用，为鼻咽癌的基因治疗提供新的实验依据。
　　方法：以凋亡抑制基因Survivin为靶位，构建表达小干扰 RNA(siRNA)的真核表达载体，经脂质体转染鼻咽癌细胞系 CNE-2，应用RT-PCR检测鼻咽癌细胞中Survivin mRNA表达抑制情况，初步鉴定干扰效果。
　　结果：重组载体 pGPU6/GFP/Neo-shRNA1,2,3,4,N经双酶切和基因测序检测,证实碱基序列与模板序列相符，无基因突变，载体构建成功。重组载体经脂质体Lipofectamine2000介导转染鼻咽癌细胞，细胞发生不同程度凋亡，转染效率约为55％。RT-PCR方法初步鉴定其干扰效果，以Survivin/GAPDH的相对表达来表示Survivin mRNA的变化,各组的mRNA表达相差较大，24h测得的mRNA相对于转染前有一定下降，大约在50%左右；但是随着时间延长，重组质粒的干扰作用逐渐减弱。
　　结论：本实验通过构建靶向 Survivin的shRNA真核表达载体的方法，经脂质体介导，转染鼻咽癌细胞系CNE-2，在一定程度上抑制细胞中Survivin的基因表达水平。证实了应用RNAi技术对鼻咽癌细胞生长有一定程度的抑制作用，并为鼻咽癌的基因治疗提供了新的实验数据。
　　第二部分：
　　目的：通过化学合成的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)的方法来探讨RNAi技术对鼻咽癌细胞生长抑制作用，为鼻咽癌的基因治疗提供新的实验依据。
　　方法：根据siRNA的设计原则设计针对survivin基因序列特异性的siRNA，在脂质体介导下转染CNE-2细胞。采用RT-PCR和Western blotting检测Survivin在干扰后mRNA和蛋白的表达情况，并筛选出干扰效果最好的siRNA序列进行细胞生长抑制试验（CCK-8实验）检测对细胞生长抑制作用。
　　结果：转染siRNA24h、48h和72h后，用RT-PCR和Western blotting检测，CNE-2Z细胞survivin表达明显下降，并筛选出抑制效果最好1号序列进行CCK-8实验，结果显示能明显抑制细胞生长增殖。
　　结论：靶向 Survivin的siRNA转染人鼻咽癌 CNE-2细胞有效抑制细胞中Survivin基因的表达水平，并对细胞生长增殖等生物学行为产生抑制作用。证实了应用通过化学合成的siRNA的RNAi技术对鼻咽癌细胞生长有显著的抑制作用为鼻咽癌的基因治疗提供了新的实验数据。

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中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 靶向Survivin的shRNA真核表达载体对鼻咽癌细胞的转染及干扰效果的初步鉴定

1.材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2.结果

2.1 shRNA真核表达载体的鉴定

2.2 细胞转染及转染效率评价

2.3 RT-PCR法初步检测RNA干扰效果

3.讨论

4.结论

第二部分 靶向Survivin的siRNA对鼻咽癌细胞的生长抑制作用

1.材料和方法

1.1材料

1.2方法

2. 结果

2.1 细胞转染及转染效率

2.2 RT- PCR法检测RNA干扰效果

2.3 Western blot法检测蛋白表达

2.4 细胞生长抑制实验

3.讨论

4.结论

参考文献

综述：Survivin对头颈鳞癌细胞增殖凋和亡作用的研究

主要英文缩略语索引

攻读学位期间的研究成果

致谢