中国林蛙抗菌肽的分离纯化及cDNA克隆

摘要

本研究通过反相高效液相法从中国林蛙皮肤分泌物中分离、纯化得到3种多肽，经抑菌试验分析表明，其中两种多肽具有较强的抑菌活性。将其进行Tris-TricineSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，测定其分子量为7.0kDa左右，经PVDF转膜后，利用Edaman降解法分别测定其N末端10个氨基酸序列。然后应用在线程序CODEHOP(Consensus-degeneratehybridoligonucleotideprimers)设计简并引物，同时提取蛙皮总RNA，采用RT-PCR及RACE法，首次克隆得到两条中国林蛙抗菌肽基因cDNA序列，分别命名为CAMPs-1(GenBanK登录号：DQ471289)和CAMPs-2(GenBanK登录号：DQ471290)，CAMPs-1基因cDNA序列全长为285bp，其中包括183bp完整的开放阅读框(openreadingframe，ORF)，推测编码61个氨基酸的多肽(chensirin-1)，分子量(MW)为7.103kDa，同时含有102bp的3’非转译区(3'UTR)；CAMPs-2基因cDNA序列全长为279bp，其中包括177bp完整的开放阅读框(openreadingframe，ORF)，推测编码59个氨基酸的多肽(chensirin-2)，分子量(MW)为6.980kDa，同时含有102bp的3’非转译区(3'UTR)。生物信息学分析表明，CAMPs-1和CAMPs-2氨基酸序列(即chensirin-1,chensirin-2)N末端均含有一个相对保守的由22个氨基酸组成的信号肽序列。通过chensirin-1和chensirin-2与已克隆的蛙属抗菌肽序列的Blast比对及系统进化树分析显示，其与蛙属抗菌肽的同源性较高，分别为63﹪～86﹪和57﹪～81﹪，说明chensirin-1和chensirin-2为蛙属抗菌肽家族的两个新成Z员。 综上所述，利用3’RACE技术首次从中国林蛙皮肤中分离到中国林蛙抗菌肽基因CAMPs-1、CAMPs-2，并对其基因特性、表达模式进行生物信息学分析，同时为今后进一步研究中国林蛙抗菌肽的分子机制及高效原核、真核表达载体的构建奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章前言

第二章材料和方法

第三章结果与分析

第四章结论

参考文献

附录：主要溶液与缓冲液

致谢