DAXX亚细胞定位对ox-LDL诱导巨噬细胞凋亡的影响

摘要

目的:观察DAXX的亚细胞定位对ox-LDL诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡的影响，为开辟以DAXX的亚细胞定位为手段，稳定斑块、防治急性冠脉综合征的新途径提供理论依据。
　　方法：构建人源性DAXX胞核定位突变质粒DAXX（S667A）、胞浆定位突变质粒DAXX（W621A）；瞬时转染RAW264.7巨噬细胞，应用RT-PCR和Western Blot技术检测转染后细胞内DAXX的表达情况和转染效率；同时，应用免疫荧光法观察DAXX在细胞中的定位情况；转染24h后用100μg/mL ox-LDL孵育48h，诱导细胞凋亡，MTT法检测细胞活性，流式细胞术观察细胞凋亡情况。应用 RT-PCR和Western Blot分别检测ASKI和JNK的mRNA和蛋白的表达情况。
　　结果：DAXX的两个突变重组质粒DAXX（S667A）和DAXX（W621A）经琼脂糖凝胶电泳和DNA测序分析，证实突变正确，无其它突变和读码框移位。RT-PCR和Western Blot法检测转染后细胞内DAXX表达的升高有显著性差异，表明转染效率达到实验要求。免疫荧光法观察到DAXX（WT）在胞核胞浆均有表达，且主要定位于胞核；质粒DAXX(S667A)定位胞核；质粒DAXX(W621A)定位胞浆。瞬时转染24h后细胞经100μg/ml ox-LDL孵育48h，与正常对照组比较，MTT法和流式细胞术检测发现：转 DAXX(W621A)组细胞活性显著下调，凋亡率明显上升（p＜0.05）；转DAXX(S667A)组细胞活性有所上调，且凋亡率下降；同时，RT-PCR和Western Blot检测发现：转DAXX(W621A)组细胞中ASK1和JNK的mRNA和蛋白表达显著高于正常组（p＜0.05），而转染DAXX(S667A)组细胞中ASK1和JNK的表达均低于正常对照组。
　　结论：胞核定位DAXX可以抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡；胞浆定位DAXX可以增敏ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡；其凋亡通路可能与ASK1-JNK介导的信号通路有关。

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引言

实 验 材 料

一、 主要仪器

二、主要试剂

实 验 方 法

一、主要溶液的配制

二、胞核定位载体 pcDNA3.1(+)-DAXX-S667A 和胞浆定位载体pcDNA3.1(+)-DAXX-W621A的构建

三、RAW264.7细胞培养及瞬时转染

四、RT-PCR

五、Western Blot检测蛋白的表达

六、免疫荧光法检测RAW264.7细胞中DAXX、DAXX(W621A)、DAXX(S667A)定位情况

七、MTT法检测细胞的活力

八、流式细胞术检测细胞凋亡率

九、统计学方法

实验结果

1 pcDNA3.1(+)-DAXX-S667A 和 pcDNA3.1(+)-DAXX-W621A真核表达载体的构建和鉴定

2 瞬时转染RAW264.7细胞后转染效率的检测和DAXX定位的观察

3 用 MTT 法和流式细胞术检测不同亚细胞定位 DAXX 对ox-LDL孵育后RAW264.7细胞的影响

4 不同亚细胞定位DAXX对 ox-LDL处理的细胞内ASK1，JNK的mRNA和蛋白表达的影响

讨论

结论

参考文献

综述

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