Bcl-xl基因3′UTR let-7b靶位点SNP对BEL-7402细胞5-FU敏感性的影响

摘要

目的：研究 SNP rs3208684(A＞C)对let-7b调控 Bcl-xl基因的影响，以及对肝癌BEL-7402细胞5-FU药物敏感性的影响。
　　方法：生物信息学预测Bcl-xl基因3′UTR miRNA结合位点，结合PUBMED SNP数据库搜寻位于miRNA结合位点内的SNP。体外培养人HCC BEL-7402细胞，转染miRNA mimics、野生型或突变型pcDNA3.1-Bcl-xl真核表达载体。采用MTT法检测细胞转染后对5-FU的敏感性；Western blot检测Bcl-xl、Bax蛋白的表达；双荧光素酶法验证let-7b对Bcl-xl的靶向作用和SNP rs3208684(A＞C)对let-7b靶向调控Bcl-xl表达的影响。
　　结果：生物信息学预测软件显示 Bcl-xl基因3′UTR存在 let-7b的结合位点，结合PUBMED SNP数据库搜索发现在 Bcl-xl基因3′UTR let-7b结合位点内存在 SNP rs3208684(A＞C)。
　　MTT检测、Western blot检测，发现let-7b mimics转染组与正常对照组及let-7b阴性对照组比较，BEL-7402细胞对5-FU敏感性增加(P<0.05)，Bcl-xl蛋白表达下调(P<0.05)，但Bax蛋白表达无明显变化。
　　MTT检测、Western blot检测，发现与let-7b mimics+野生型Bcl-xl载体共转染组、阴性对照组比较，let-7b mimics+突变型 Bcl-xl载体共转染组 Bcl-xl蛋白表达增高(P<0.05)，Bax蛋白无明显改变，BEL-7402细胞对5-FU敏感性降低(P<0.05)。
　　MTT检测、Western blot检测，发现与空载体对照组及未转染组比较，野生型Bcl-xl载体转染组和突变型Bcl-xl载体转染组Bcl-xl蛋白表达均增高(P<0.05)，Bax蛋白无明显改变，BEL-7402细胞对5-FU敏感性降低(P<0.05)；与野生型Bcl-xl载体转染组比较，突变型Bcl-xl载体转染组BEL-7402细胞对5-FU敏感性显著降低(P<0.05)，但 Bcl-xl、Bax蛋白表达无明显差异(P﹥0.05)。
　　双荧光素酶法实验显示，与let-7b阴性对照+野生型Bcl-xl3′UTR载体共转染组比较，let-7b mimics+野生型Bcl-xl3′UTR载体共转染组萤火虫荧光素酶活性显著降低(P<0.01)；与let-7b阴性对照+突变型Bcl-xl3′UTR载体共转染组比较，let-7b mimics+突变型Bcl-xl3′UTR载体共转染组萤火虫荧光素酶活性无明显变化(P﹥0.05)。
　　结论：let-7b能够靶向下调Bcl-xl蛋白的表达，增加BEL-7402细胞对5-FU的敏感性；SNP rs3208684(A＞C)能够干扰miRNA let-7b对Bcl-xl基因的靶向调控作用，降低BEL-7402细胞对5-FU的敏感性。

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本研究受到下列科研项目资助

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英文摘要

前言

实验材料

1 材料与试剂

2 主要仪器

3 主要溶液配制

实验方法

1 BEL-7402细胞培养

2 miRNA 靶标预测

3 野生型及突变型Bcl-xl质粒表达载体构建

4 质粒提取

5 瞬时转染

6 Western blot 检测

7 MTT检测

8 双荧光素酶活性检测

9 统计分析

实验结果

1 生物信息学筛选目的miRNA和SNP

2 野生型或突变型pcDNA3.1-Bcl-xl真核表达载体鉴定

3 Let-7b增加BEL-7402细胞对5-FU的药物敏感性

4 Let-7b下调BEL-7402细胞Bcl-xl蛋白的表达

5 Let-7b靶向作用Bcl-xl 3′UTR 抑制其表达

6 SNP rs3208684(A＞C)对let-7b调控BEL-7402细胞5-FU药物

7 SNP rs3208684(A＞C)对 let-7b 调控 BEL-7402 细胞 Bcl-xl蛋白表达的影响

8.SNP rs3208684(A＞C)对let-7b靶向Bcl-xl 3′UTR的影响

9 SNP rs3208684(A＞C)对BEL-7402细胞5-FU药物敏感性的影响

10 SNPrs3208684(A＞C)对BEL-7402细胞Bcl-xl蛋白表达的影响

讨论

结论

参考文献

综述

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