我国嗜热弯曲菌PCR和核酸探针检测方法的建立与应用

摘要

本研究建立了检测我国嗜热弯曲菌的PCR和核酸探针检测方法，简化了检验流程、提高检测效率，并应用于实际样品的检测。选择空肠/结肠弯曲菌同源性较高的16SrRNA为扩增目的基因，应用Primer5.0软件设计引物，建立快速检测鸡肉中空肠/结肠弯曲菌的PCR方法。PCR循环参数为：94℃预变性4min、94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸1min，25个循环后再72℃彻底延伸4min。最佳反应条件为：模板10-3倍稀释，引物最佳浓度为0.4μmol/L，MgCl2最佳浓度为1.0mmol/L。该方法能够特异性的扩增出空肠/结肠弯曲菌287bp核苷酸片段，而对胎儿弯曲菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肠炎沙门氏菌、产气夹膜梭菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓假单胞菌和单核细胞增生性李斯特氏菌等非空肠/结肠弯曲菌均不能扩增出目的片段，敏感性试验的检测限度为5cfu/mL。 在PCR方法建立的基础上，在已扩增的特异性和敏感性较好的空肠/结肠弯曲菌16SrRNA上设计核酸探针，探针大小21bp，具有寡核苷酸探针的优点。此方法利用化学发光物质吖啶酯标记寡核苷酸探针，所设计的探针能够与目的核苷酸探针杂交，形成DNA-RNA杂交体，杂交后无需分离步骤，利用差分水解(Differentialhydrolysis)鉴别，即先加入弱碱性溶液，未经杂交的发光探针失去发光特性(半衰期小于1min)，而与靶细胞杂交的探针可以保护吖啶酯不在碱性环境下水解。因为吖啶酯平面结构镶嵌于杂交体双螺旋的内部，受到空间位阻的保护，水解速度缓慢(半衰期10min以上)，仍有发光性能，再加入碱性H2O2进行检测时，能够在发光仪上检测到发光，整个试验过程只需要30min。此方法称为核酸杂交保护分析，目前在我国还很少应用。 取空肠弯曲菌标准株的纯培养菌落进行核酸杂交保护分析的试验，通过条件的筛选和优化，此方法能够特异性的检测出空肠/结肠弯曲菌，而对胎儿弯曲菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌、副溶血性弧菌、产气夹膜梭菌、绿脓假单胞菌、单增李斯特杆菌等非空肠/结肠弯曲菌均检测为阴性结果。挑取不同个数的阳性菌落进行敏感性试验，最低检测限度为1个菌落。 将建立的PCR方法和核酸杂交保护分析方法应用于送检的100份鸡肉样品的检测，在分离培养的过程中，分别提取鸡肉肉水、增菌液和纯培养菌落进行PCR检测，对纯培养菌落进行核酸杂交保护分析检测，并与常规生化鉴定结果对比，PCR检测阳性率分别为16﹪(16/100)、24﹪(24/100)和20﹪(20/100)，核酸杂交保护分析检测阳性率为20﹪(20/100)，生化鉴定检出率为20﹪(20/100)。 应用结果显示，本研究所建了的检测我国嗜热弯曲菌的PCR方法和核酸杂交保护分析方法具有简便、快速、准确可靠的优势，具有广泛的应用价值。

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文摘

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前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

致谢

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