血红素活性中心组氨酸对肌红蛋白过氧化物酶催化功能的调控研究

摘要

蛋白的稳定性及正确折叠是其执行各种生物功能的基础，因此蛋白质分子结构与功能的研究一直是生命科学研究的热点。肌红蛋白（Myoglobin，Mb）是目前人类研究最多的蛋白质之一。
　　研究人员一般通过对Mb的氨基酸进行突变或对其血红素活性中心进行修饰，来研究Mb的结构和功能之间的关系。为了进一步研究Mb的氨基酸残基对蛋白结构与功能的影响，从而进一步了解Mb的结构与功能之间的关系，本课题我们在大肠杆菌中表达和纯化得到Mb突变体蛋白，进而用紫外可见光谱等，考察其结构与功能。
　　通过制备感受态大肠杆菌、细胞转化、接种、扩大培养、诱导表达使突变肌红蛋白高效表达，再经过收菌、超声破菌、超滤、阴离子交换层析、超滤、凝胶层析或透析纯化突变肌红蛋白，分别获得29位亮氨酸(Leu，L)突变为组氨酸(His， H)的Mb突变体L29H Mb、29位亮氨酸和43位苯丙氨酸(Phe，F)均突变为组氨酸的Mb突变体L29H/F43H Mb。
　　本论文通过对肌红蛋白突变体L29H Mb进行实验研究，探索Mb活性中心双组氨酸(His29/His64)在蛋白催化功能中的作用。通过实验发现：在氧化邻甲氧基苯酚时，L29H Mb中存在的两个组氨酸起到协同作用，L29H Mb的过氧化物酶活性比野生型Mb（wild-type Mb，WT Mb）的过氧化物酶活性高3.7倍。
　　此外，突变体L29H/F43H Mb中三个远端组氨酸形成金属结合位点，本论文分别研究L29H/F43H Mb的过氧化物酶活性及其结合了Cu(II)、Zn(II)后的过氧化物酶活性。研究表明，Cu(II)、Zn(II)金属离子的结合，会不同程度地抑制L29H/F43H Mb的过氧化物酶活性，这为天然细胞色素c氧化酶表现出低的过氧化物酶催化活性提供了有价值的信息。
　　本论文为Mb的结构与功能关系提供了新信息，也为血红素蛋白的理性设计提供新思路和新方法。

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英文摘要

第一章 前 言

1.1 研究背景

1.1.1血红素蛋白简介

1.1.2 肌红蛋白的结构

1.1.3 肌红蛋白的功能特点

1.1.4 肌红蛋白的过氧化物酶活性

1.1.5 肌红蛋白分子内部金属结合位点的设计

1.2 研究现状和意义

1.2.1 研究现状

1.2.2 研究意义

1.3 研究内容和创新之处

1.3.1 研究内容

1.3.2 创新之处

第二章 具有两个远端组氨酸肌红蛋白突变体蛋白L29H Mb的纯化及表征

引言

2.1 实验部分

2.1.1 仪器

2.1.2 试剂

2.1.3 菌株、质粒及蛋白

2.1.4 蛋白（WT Mb和L29H Mb）的表达及纯化

2.1.5 分析方法

2.2 结果与讨论

2.2.1 WT Mb及L29H Mb的紫外可见吸收光谱

2.2.2 L29H Mb的理论模拟研究

2.2.3 L29H Mb的过氧化物酶催化功能

2.3 结论

第三章 具有三个远端组氨酸肌红蛋白突变体蛋白L29H/F43H Mb的纯化及表征

引言

3.1 实验部分

3.1.1 仪器

3.1.2 试剂

3.1.3 菌株、质粒及蛋白

3.1.4 L29H/F43H Mb的表达及纯化

3.1.5 分析方法

3.2 结果与讨论

3.2.1 L29H/F43H Mb的紫外可见吸收光谱

3.2.2 L29H/F43H Mb的过氧化物酶活性

3.2.3 金属离子对L29H/F43H Mb过氧化物酶活性的影响

3.3 结论

参考文献

已/待发表论文目录

致谢