PRDM2基因启动子甲基化参与肺鳞癌发病机制

摘要

目的：PRDM2基因是PRDM抑癌基因家族的重要成员，在多种肿瘤中因为启动子甲基化而出现基因表达降低或缺失。关于PRDM2与肺癌的相关研究尚未见报道。5-杂氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2dC）是甲基转移酶抑制剂，能够降低基因的甲基化水平。
　　方法：
　　1.体外培养肺鳞癌SK-MES-1细胞，用梯度浓度5-aza-2dC对细胞进行处理，采用MTT法检测细胞生长曲线；MSP、RT-PCR及Western-blot方法分别测定PRDM2基因启动子甲基化状态、mRNA和蛋白质表达水平。
　　2.22只BAL B/c裸小鼠随机分为对照组与5-aza-2dC治疗组（简称治疗组），采用皮下注射SK-MES-1细胞建立移植瘤模型；待移植瘤短径达到0.5cm时，治疗组按照1μg/g体重每周3次5-aza-2-dC腹腔注射给药治疗4周，对照组予以等量5-aza-2-dC溶媒（PBS）每周3次腹腔注射对照4周，观察移植瘤生长情况；4周后取出移植瘤，采用MSP法检测移植瘤PRDM2基因甲基化状态，RT-PCR和Western-blot方法检测移植瘤PRDM2基因mRNA和蛋白质表达水平。
　　结果：5-aza-2-dC对SK-MES-1细胞具有生长抑制效应,效用强弱呈现浓度依赖性；SK-MES-1细胞PRDM2基因启动子处于高度甲基化状态，5-aza-2-dC处理能够浓度依赖性地降低 PRDM2基因启动子的甲基化程度，并浓度依赖性地上调 PRDM2基因mRNA、蛋白质表达水平（0μmol/L5-aza-2-dC组、1μmol/L5-aza-2-dC组、5μmol/L5-aza-2-dC组mRNA表达水平分别为0.18±0.04、0.32±0.07、0.41±0.09，组间比较p<0.05，差异有统计学意义；蛋白质表达水平分别为0.21±0.05、0.38±0.09、0.62±0.11，组间比较p<0.05，差异有统计学意义）。裸鼠荷瘤过程中，治疗组移植瘤生长速度慢于对照组，至荷瘤结束时，治疗组和对照组移植瘤的体积分别为（570±196）mm3和（1499±350）mm3，两组之间具有显著性差异（t=7.303,p<0.01）。MSP检测结果显示：对照组裸鼠移植瘤PRDM2基因启动子甲基化频率为81.8％，治疗组裸鼠移植瘤PRDM2基因启动子甲基化频率为27.3%。对照组和治疗组PRDM2mRNA分别为0.1703±0.1201和0.5322±0.090，蛋白质表达水平分别为0.1451±0.1012和0.5125±0.4902,差异有统计学意义（p<0.05）。
　　结论：
　　1.肺鳞癌SK-MES-1细胞PRDM2基因启动子处于高甲基化状态，5-aza-2-dC能够浓度依赖性地降低SK-MES-1细胞PRDM2基因启动子甲基化水平，并相应地上调PRDM2mRNA及蛋白质表达水平。
　　2.5-aza-2-dC腹腔注射治疗能够降低裸鼠SK-MES-1细胞移植瘤PRDM2基因启动子的甲基化状态，上调PRDM2基因的mRNA及蛋白质表达水平，并抑制移植瘤的生长速度。

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主要缩略词

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英文摘要

前言

实验材料

一. 主要试剂来源

二．主要仪器设备

实验方法

1.细胞系与实验动物来源

2.细胞培养与分组处理

3.MTT法检测细胞生长曲线

4.肺鳞癌裸鼠模型的建立及药物处理

5.Western-blot 检测 SK-MES-1 细胞和裸鼠肺鳞癌皮下移植瘤组织PRDM2蛋白表达

6.RT-PCR

7.MSP检测肺鳞癌细胞和裸鼠皮下移植瘤中PRDM2基因甲基化

8.统计分析

实 验 结 果

1.细胞实验

2.动物实验

讨论

结论

参考文献

附图

综 述1

参考文献

硕士期间撰写论文

致谢