HA纳米载体介导hGM-CSF基因转染制备肝癌疫苗的实验研究

摘要

目的:肿瘤的复发和转移主要是因机体的抗肿瘤免疫功能低下而产生的,表现为免疫逃逸和免疫耐受;肿瘤疫苗通过增强肿瘤的抗原性而重建机体的免疫功能,已成为肿瘤防治的一种新疗法,而将hGM-CSF基因转入肿瘤细胞可使细胞的免疫原性大大增加。本研究通过具有良好的生物相溶性的HA纳米颗粒携带hGM-CSF基因进行转染,制备成转hGM-CSF基因的肝癌疫苗,并且观察HA纳米载体用于基因转染的安全性及hGM-CSF基因对肝癌细胞生长的影响,为基因修饰的自体肝癌疫苗的临床研究奠定基础。
　　方法:采集新鲜的肝癌组织,将其剪切、消化、离心制备成单细胞悬液,台盘兰染色分析细胞活力后进行常规细胞培养、传代,通过检测培养液中的AFP及ALB分泌水平以进行肝癌细胞鉴定。采用MTT方法检测HA纳米载体对肝癌细胞的生长的影响。用HA纳米载体转染技术,将携带有人GM-CSF基因的表达质粒导入肝癌细胞中,筛选G418抗性细胞,限制性稀释法挑选G418抗性单克隆;采用RT-PCR方法鉴定hGM-CSF基因的整合和表达,ELISA方法测定细胞培养液中的hGM-CSF分泌量和持续的时间;流式细胞术分析hGM-CSF基因对肝癌细胞生长的影响;经致亚死量的r-射线照射制备成肝癌细胞疫苗。
　　结果:台盘兰染色分析分离的肝癌细胞细胞活力在80％以上,且在细胞培养液上清中测得有大量的AFP及少量ALB存在,对照培养基中只检测到微量AFP及未检测到ALB;MTT结果分析表明HA纳米混悬液浓度在80μg/ml以下对肝癌细胞生长的影响与对照组比较差异无显著性。RT-PCR显示hGM-CSF基因在肝癌细胞中已整合及稳定表达。ELISA检测出转入hGM-CSF基因的肝癌细胞能稳定分泌hGM-CSF,其分泌量为216.22±45.78ng/106cell/24h。流式细胞检测结果显示hGM-CSF基因不促进细胞凋亡,且对细胞的生长周期无明显影响。
　　结论:成功的从肝癌组织中分离培养出肝癌细胞;运用HA纳米载体可以安全的将目的基因hGM-CSF导入肝癌细胞中且获得稳定表达,成功制备成转hGM-CSF基因肝癌细胞疫苗,并且该基因对细胞的生长无明显影响,为基因修饰的肝癌疫苗的后继研究提供了实验基础。

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主要缩略语及英文索引

中文摘要

英文摘要

前言

一．材料和方法

1. 材料

1.1 主要试剂的配制

1.2 其他试剂

1.3 仪器设备

2. 方法

2.1 肝癌细胞的分离、培养及鉴定:

2.2 肝癌细胞培养

2.3 质粒转导与扩增

2.4 质粒抽提

2.5空载体pORF-neo+的制备

2.6 HA纳米颗粒混悬液的制备

2.7 MTT方法检测HA纳米载体对肝癌细胞的生长的影响：

2.8 HA纳米载体介导pORF-hGM-CSF基因转染及细胞筛选：

2.9 RT-PCR检测hGM-CSF基因在肝癌细胞中的表达：

2.9 培养基中hGM-CSF分泌量的测定：

2.10 流式细胞仪分析hGM-CSF基因对肝癌细胞生长状态及细胞周期的影响：

2.11 经r-射线照射制备成肝癌细胞疫苗

2.12 统计学处理：

三：结 果

1． 肝癌细胞的分离及鉴定

1.1 分离培养的肝癌细胞

1.2 肝癌细胞的鉴定

2． hGM-CSF基因载体序列

2.1 质粒载体构成组分

2.2 质粒全部DNA编码序列

3. 质粒pORF hGM-CSF的酶切分析

4. MTT法检测HA纳米混悬液对肝癌细胞生长的影响

5. 肝癌细胞的转染

6. RT-PCR分析

7.培养基中hGM-CSF的定量测定及分析

8.流式细胞术分析hGM-CSF+/-肝癌细胞生长状态及细胞周期

8.1 细胞凋亡率检测

8.2 细胞周期分析:

9.肝癌细胞疫苗的制备及保存

四. 讨 论

结论

参考文献

综述:

成 果 目 录

致谢