DATS通过诱导HL-60细胞产生ROS激活JNK的分子机制

摘要

目的:探讨DATS诱导HL-60细胞JNK活化的分子机制及活性氧在这一过程中的作用。
　　方法:用浓度为50、100、150μM的DATS处理HL-60细胞0、0.5、1、3、6、12h,流式细胞术检测细胞内的ROS水平。用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)预孵育HL-60细胞30min后,再用150μM DATS处理HL-60细胞0、0.5、1、3、6、12h,流式细胞术检测细胞内的ROS水平;蛋白印迹法检测JNK、c-Jun、GST-π和JIP的表达及JNK、c-Jun和MLK3的磷酸化水平;免疫共沉淀和蛋白印迹技术分析GST-π与JNK、JIP与JNK的结合情况;用MLK特异性阻滞剂CEP-1347或JNK特异性阻滞剂SP600125预处理后,观察150μM DATS处理细胞3h后,HL-60细胞JNK、c-Jun磷酸化的变化。
　　结果:不同浓度DATS处理HL-60细胞不同时间后,细胞流式检测显示ROS的产生与DATS处理呈时间剂量依赖关系,在0.5-3h随着DATS处理时间和浓度的升高而升高,ROS的荧光强度在3h、150μM时达到最高峰,值为89.7±3.67,其后维持在一个较高水平。
　　DATS处理HL-60细胞在12h内,几乎不影响JNK蛋白的表达,c-Jun蛋白表达在前3h内有所增高,随后趋于稳定;JNK的磷酸化水平在 DATS处理3h内显著增高,3h达到最高峰,随后稍有下降;c-Jun、MLK3的磷酸化水平随着时间的延长而增加,NAC能不同程度的抑制DATS诱导的c-Jun的表达及JNK、c-Jun的磷酸化;CEP-1347预处理细胞能降低DATS诱导的JNK的磷酸化水平,SP600125预处理细胞能显著降低DATS诱导的c-Jun的磷酸化水平。
　　DATS处理细胞6h内,几乎不影响GST-π的表达,12h时,DATS能抑制GST-π的表达;DATS处理几乎不影响JIP的表达;DATS处理HL-60细胞0-3h,DATS能诱导GST-π与JNK复合物的解离,3h时GST-π与JNK基本处于解离状态,3h后GST-π重新与JNK结合,NAC能显著抑制DATS诱导的GST-π与JNK复合物的解离;DATS处理HL-60细胞0-3h,DATS能诱导JIP与JNK复合物的形成,3小时以后JIP与JNK复合物逐渐解离。NAC对JIP与JNK复合物的形成无明显影响。
　　结论:
　　1.DATS能诱导HL-60细胞产生ROS及MLK3、JNK和c-Jun的磷酸化;
　　2.DATS诱导产生的ROS能介导MLK3/JNK/c-Jun磷酸化,并促进GST-π-JNK复合物的解离;
　　3.DATS可通过活化MLK3和解除GST-π对JNK的抑制作用,激活HL-60细胞JNK。

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中文摘要

英文摘要

前言

实验材料

一.细胞系

二.主要试剂

三 仪器及设备

实验方法

一．细胞培养及处理

二. 细胞流式仪检测活性氧的产生

三. Western blot检测蛋白表达的影响

四. 免疫共沉淀检测蛋白JNK与GST-π、JIP结合情况

五. 统计学方法

实 验 结 果

一、 DATS对HL-60细胞ROS产生的影响

二、NAC对HL-60细胞ROS产生的影响

三、DATS对HL-60细胞JNK、c-Jun表达及其磷酸化的影响

四、ROS在DATS诱导JNK、c-Jun的表达及磷酸化过程中的作用

五、DATS诱导HL-60细胞JNK活化的分子机制及ROS的作用

讨论

结论

参考文献

致谢