pcsk9siRNA对oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞凋亡的影响

摘要

人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type9,pcsk9)基因编码神经细胞凋亡调节转化酶-1蛋白(neural apoptosis regulated convertase1,NARC-1),该基因属于蛋白转化酶家族。pcsk9/NARC-1通过调节细胞表面低密度脂蛋白受体,从而在胆固醇代谢中发挥重要作用;其两种不同突变类型,可导致血液中胆固醇水平完全相反的变化,出现低胆固醇血症或高胆固醇血症。最近发现pcsk9/NARC-1可能还影响神经系统分化,调节神经元凋亡。研究pcsk9与巨噬细胞凋亡之间的关系,进而探索pcsk9在动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)发生中的作用及机制,将有助于动脉粥样硬化发病机制的研究,也能为防治动脉粥样硬化提供新思路。本研究以 THP-1源性巨噬细胞为研究对象,经过不同浓度氧化低密度脂蛋白(oxidized Low Density Lipoprotein,oxLDL)处理后,观察巨噬细胞的凋亡及pcsk9表达变化,观察pcsk9基因沉默之后对这种凋亡作用的影响,为pcsk9在动脉粥样硬化发生发展中的作用提供实验依据。
　　目的:观察pcsk9在不同浓度oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞中表达及巨噬细胞凋亡情况,研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对pcsk9基因抑制作用以及pcsk9 siRNA对oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞凋亡的影响。
　　方法:THP-1源性巨噬细胞与160nmol/L的佛波酯孵育24h,诱导成贴壁的巨噬细胞后,用0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml的oxLDL处理48h,Hoechst33258染色检测细胞凋亡,RT-PCR、Western blot分别检测THP-1源性巨噬细胞pcsk9 mRNA、NARC-1蛋白质的表达。设计制备三对针对pcsk9基因不同位点的siRNA,通过阳离子脂质体Lipofectamine2000转染入THP-1源性巨噬细胞。6h后荧光显微镜评价转染效率,分别在转染24h、48h后从mRNA、蛋白水平观察pcsk9沉默效率,从而筛选出最有效的siRNA转染入THP-1源性巨噬细胞24h后,加入75μg/ml oxLDL处理48h,Hoechst33258染色观察细胞形态评价细胞凋亡,流式细胞计数检测细胞凋亡率。
　　结果:不同浓度的oxLDL处理 THP-1源性巨噬细胞48h后,Hoechst33258染色,荧光显微镜下观察细胞,在75μg/ml组出现大量的细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞。同时RT-PCR、Western blotting检测发现,随着 oxLDL浓度的增加,pcsk9mRNA和NARC-1蛋白质表达量均增加,75μg/ml oxLDL组增加最明显。荧光标记的siRNA(FAM-siRNA)转染细胞6h后,荧光显微镜下观察,成功转染的细胞可见绿色荧光散在分布在细胞质中,未转染的细胞未见荧光。30nmol/L、50nmol/L、80nmol/L的siRNA转染THP-1源性巨噬细胞后,RT-PCR筛选出三对siRNA的终浓度为80nmol/L均可出现明显的沉默效应。选取此浓度检测蛋白水平基因抑制情况,筛选出最有效的一对siRNA。将筛选出来的siRNA-2转染 THP-1源性巨噬细胞24h后,再用 oxLDL处理48h后,Hoechst33258染色及流式细胞计数结果显示转染siRNA组凋亡明显被抑制。
　　结论:在本实验研究的浓度范围内,随着oxLDL浓度的增加pcsk9的表达随之增加,同时THP-1源性巨噬细胞凋亡也明显增加,75μg/ml oxLDL最明显,pcsk9mRNA和蛋白的表达也在该浓度最高;pcsk9siRNA能有效抑制pcsk9基因的表达;pcsk9 siRNA能有效抑制经oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞的凋亡。

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前言

实 验 材 料

1.1细胞和主要试剂来源

1.2主要仪器

实 验 方 法

2.1细胞培养

2.2脂蛋白的分离、氧化修饰及鉴定

2.3 Hoechst33258染色观察THP-1源性巨噬细胞凋亡

2.4逆转录-聚合酶链反应检测pcsk9mRNA的表达

2.5 Western blot检测NARC-1蛋白质的表达

2.6筛选有效的siRNA

2.7 pcsk9 siRNA对oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞凋亡测定

2.8图像分析和统计学处理

实 验 结 果

3.1 oxLDL处理THP-1源性巨噬细胞后Hoechst33258染色结果

3.2 oxLDL对THP-1源性巨噬细胞中pcsk9/NARC-1表达的影响

3.3荧光标记的siRNA(FAM-siRNA)转染鉴定结果

3.4 pcsk9siRNA对THP-1源性巨噬细胞pcsk9mRNA表达的影响

3.5 pcsk9siRNA对THP-1源性巨噬细胞NARC-1表达的影响

讨论

结论

参考文献

主要英文缩略语索引

综述

硕士期间发表的论文

致谢