NSC移植对颈上交感神经节损毁兔MAP-2、GFAP表达的影响

摘要

目的：
　　建立兔颈上交感神经节（superior cervical sympathetic ganglion,SCSG）损毁模型，用诱导分化的骨髓源神经干细胞(Neuron stem cells,NSC)对其移植，观察兔瞳孔恢复情况，检测受损SCSG内微管相关蛋白2（microtubule associated protein2,MAP2）及胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）的变化，探讨神经干细胞对神经损伤的修复作用及可能途径。
　　方法：
　　取新生1周新西兰白兔股骨骨髓，经全骨髓密度梯度离心联合贴壁培养法得到兔骨髓间充质干细胞（bone marrow derived stroma cells,BMSCs），用碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF）定向诱导为神经干细胞，并分别鉴定BMSCs及神经干细胞的表型特征。
　　用直持针钳压榨兔SCSG、每次压榨10s，制备兔SCSG损毁模型（24只），造模成功后随机分为三组（每组8只）：模型对照组（B组），培养液对照组（C组），神经干细胞干预组（D组）。A组为正常组（8只），不进行造模。
　　SCSG损毁模型成功后第7天，B组用注射器经耳缘静脉缓慢注射1ml生理盐水，C组注射1ml神经干细胞培养液，D组注射1ml含2×106个神经干细胞的神经干细胞培养液。分别于移植后第1天、第7天、第10天、第14天、第21天观察记录四组兔损伤侧瞳孔直径变化；移植第21天后处死兔，取损毁侧兔SCSG，免疫组化检测其MAP-2、GFAP的变化情况。
　　结果：
　　1：兔SCSG损毁后，损毁侧表现出Horner综合征：瞳孔缩小，睑裂变小，眼球凹陷；造模后28天Horner综合征表现仍较突出。
　　2：分离培养的兔BMSCs，免疫细胞化学检测结果提示CD44、CD54呈阳性表达，CD34呈阴性表达，符合BMSCs的表型特征；诱导后的神经干细胞，NSE、Nestin免疫细胞化学检测结果均呈阳性表达，符合神经干细胞的表型特征。
　　3：瞳孔直径测量(mm)，移植后第1、7、10、14、21，A组右侧瞳孔分别为：7.92+0.38,8.02+0.30,8.13+0.37,7.96+0.36,8.12+0.25；B组：5.82+0.42,5.84+0.34,5.68+0.29,5.91+0.31,5.80+0.36；C组：5.85+0.32,5.75+0.32,5.64+0.37,5.84+0.27,5.59+0.23；D组：5.64+0.33,5.72+0.35，6.79+0.33,7.98+0.28,8.06+0.21；B组与C组各时间点比较差异无统计学意义（P>0.05），但均低于A组， D组与A组比较，在第1、7、10天差异有统计学意义，在第14、21天无统计学意义，D组分别与B组、C组比较，在第1、7天差异无统计学意义，在第10、14、21天差异有统计学意义（P<0.05）；各组内的比较：A、B、C组各时间点比较差异无统计学意义（P>0.05）；D组组内第7天与第1天差异无统计学意义（P>0.05）；第10天与第1、7天比较差异有统计学意义（P<0.05）；第14天与第1、7、10天比较均有统计学意义(P<0.05)；第21天与第1、7、10天比较有统计学意义（P<0.05），与第14天比较无统计学意义（P>0.05）。
　　4：病理组织观察结果：
　　（1）HE染色：B组与C组SCSG内，神经元细胞稀少，细胞排列不均匀，细胞形态、大小各异，细胞间质增生较多，血管形成较少，细胞核出现固缩,并可见炎性细胞浸润；A、D组兔SCSG内，细胞生长更紧密、排列更整齐，细胞形态及大小大体一致，有少量细胞间质增生，血管形成更丰富，细胞核无固缩现象。
　　（2）MAP-2：B组与C组神经节MAP-2呈阴性表达，A组与D组MAP-2呈阳性表达，光密度测量：A组0.787+0.245，B组0.457+0.022，C组0.447+0.020，D组0.771+0.027；B组与C组比较差异无统计学意义（P>0.05），A组D组比较差异无统计学意义（P>0.05）， A、D组分别与B组、C组比较差异有统计学意义（P<0.05）。
　　（3）GFAP：B组与C组GFAP呈阳性表达，A组与D组GFAP呈阴性表达，光密度值测量：A组0.249+0.020，B组0.640+0.038，C组0.658+0.031，D组0.271+0.022；B组与C组比较差异不明显，无统计学意义（P>0.05），A组与D组比较差异无统计学意义（P>0.05），而A组与D组明显低于B组与C组，差异均有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：
　　1、兔SCSG损毁后体内神经元的标志蛋白MAP-2下降、胶质细胞的标志蛋白GFAP增加。
　　2、神经干细胞移植对受损的兔SCSG神经功能有修复作用，其作用途径可能是通过抑制GFAP的表达、促进MAP-2的表达来实现的。

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主要英文缩略语索引

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前言

实验材料

第一部分 兔颈上交感神经节损毁模型制作预实验

1 方法

2 结果

3 结论

第二部分 神经干细胞干预兔颈上交感神经节模型的实验研究

1 兔BMSCs的培养及分化

2 神经干细胞移植治疗兔颈上交感神经节损毁模型

3 标本的免疫组化染色

4 实验结果

讨论

结论

参考文献

综述

读研究生期间发表的论文

致谢