猪轮状病毒VP7基因在栗酒裂殖酵母中的表达及鉴定

摘要

猪轮状病毒(PRV)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，为无囊膜、双股RNA病毒。该病毒是引起婴幼儿及多种幼龄动物急性腹泻并致死亡的主要病原体。在养猪生产上，A组PRV是引起幼猪腹泻的主要病毒性病原体之一。幼猪感染PRV后，因腹泻使机体免疫力急剧下降，易继发多种细菌性感染，导致幼猪成活率下降，存活者生长缓慢或停滞，给养猪业生产带来巨大经济损失。PRV含有11个节段的基因组，他们编码9种蛋白，即结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7和非结构蛋白NS34、NS35及NS28。其中构成病毒外壳主要成分的VP7蛋白，是划分病毒血清型的依据，也是诱导机体产生特异性中和抗体的最主要抗原。因此对该基因的克隆及其在酵母菌中的转化、表达、鉴定，对于进一步研究VP7蛋白在植物中的表达及研制PRV基因工程疫苗都具有重要意义。 本实验以RG-2质粒为模板，根据VP7完整序列设计引物进行PCR扩增，得到1000bp左右的特异片段。将其连接到pMD18-T载体上，通过筛选培养在加IPTG、X-gal和Amp的LB培养基上的白斑，得到重组质粒pMD18-T-VP7，经PCR和双酶切验证了PCR产物已克隆到pMD18-T-VP7重组质粒中。 用NheⅠ和BglⅡ酶切经PCR扩增的VP7基因产物，而后用AlkalinePhosphatase(Calfintestine)酶对双酶切产物进行了去磷酸化，防止VP7片段自连；纯化产物后在T4DNA连接酶的作用下，将其定向克隆到经NheⅠ和BglⅡ酶切后的pESP-2质粒上，构建成含有VP7基因的酵母重组表达载体pESP-2-VP7。以热激、电击和LiAC转化法将重组质粒pESP-2-VP7导入栗酒裂殖酵母SP-Q01中。通过在不含亮氨酸的EMM+VB1培养基筛选，鉴定重组pESP-2-VP7阳性质粒，并用PCR、双酶切和SDS-PAGE电泳方法分别对转入DH5a和SP-Q01中的重组质粒进行了鉴定。PCR检测重组质粒含有目的片段，对目的片段测序，与VP7完整序列对照，相似度为98.8﹪；双酶切重组质粒得到了VP7大小的小片段和pESP-2质粒大小的大片段；SDS-PAGE电泳亦出现了相应大小61kda左右的融合蛋白。确认了重组质粒中含有VP7序列，且构建的含VP7基因的表达载体在酵母中成功转化和表达。 同时测量了不同诱导时间对融合蛋白表达的影响，证明在1mmol/L的IPTG诱导72小时，产生的融合蛋白浓度已基本达到最大值，达到约270mg/L。诱导时间超过72小时OD值变化不大，为以后酵母罐大量生产提供一些资料。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章文献综述

第二章试验设计和试验方法

第三章结果与分析

第四章结论与讨论

参考文献

附录

致谢

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