突变敏感性分子开关筛查AAID热点基因突变的条件优化与应用研究

摘要

目的：利用高保真聚合酶结合硫代磷酸化修饰的特异性检测引物构成的突变敏感性分子开关，建立能够准确、快速识别mtDNA12S rRNA基因A1555G、C1494T、961delT三个与AAID密切相关的热点突变位点检测平台。通过该方法检测mtDNA12S rRNA基因A1555G、C1494T、961delT三个突变位点的有无，来指导AmAn的合理用药，预防AAID的发生。
　　方法：以已构建好的同时包含mtDNA12S rRNA基因A1555G、C1494T、961delT三个位点的突变型质粒和野生型质粒为模板，利用高保真聚合酶结合硫代磷酸化修饰的特异性检测引物构成的突变敏感性分子开关，对突变型质粒模板和野生型质粒模板分别进行引物延伸反应，将其PCR产物通过凝胶成像系统进行分析。通过调节PCR反应过程中退火温度、引物浓度、模板浓度等，优化PCR反应条件，然后在同一反应体系中对包含mtDNA12S rRNA基因A1555G、C1494T、961delT三位点突变型质粒模板和野生型质粒模板进行PCR反应，并通过凝胶成像系统对其 PCR产物进行分析。采用优化好的多重 PCR反应条件和反应体系，确定所建立的检测平台的灵敏性。最后利用高保真酶介导突变敏感性分子开关对临床志愿者的血液基因组DNA样本进行基因突变的筛查。
　　结果：在一定的反应体系和反应条件下，突变检测引物与野生模板不配对，无PCR产物，而与突变模板相配对，则有PCR产物。在优化 PCR反应退火温度的过程中，随着退火温度的升高，突变敏感性分子开关的特异性提高。在不同的反应体系中，重组质粒经定量后，稀释成108、107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL浓度梯度作为模板，然后再以稀释的质粒分别作为模板，本课题所构建的突变敏感性分子开关检测平台对于A1555G、C1494T的检测灵敏度达到103拷贝，特异性达到106拷贝，961delT的检测灵敏度达到102拷贝，特异性达到105拷贝，在同一反应体系的多重引物延伸反应中，对三位点突变进行同时检测，突变重组质粒经定量后，稀释成108、107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL浓度梯度作为模板，本课题所构建的突变敏感分子开关检测平台对于三位点同时检测的灵敏度达到104拷贝。突变敏感性分子开关对50例临床志愿者mtDNA12S rRNA基因 A1555G、C1494T、961delT突变的筛查均没有发现 A1555G、C1494T、961delT突变携带者。
　　结论：利用突变敏感性分子开关技术，建立了快速筛查AAID相关的三热点突变的检测平台，从而对氨基糖苷类抗生素的临床用药进行指导，预防AAID的发生。

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中文摘要

英文摘要

目录

第1章 绪 论

第2章 实 验 材 料

2.1主要仪器

2.2主要试剂

2.3其他

第3章 实 验 方 法

3.1 与生物信息学相关的网站及软件

3.2 主要溶液的配制

3.3 检测引物的设计

3.4 体外制备含有热点突变位点的野生型和突变型模板

3.5利用分子开关，在不同反应体系中对mtDNA 12SrRNA基因A1555G、C1494T和961delT三个突变分别进行检测

3.6利用分子开关，在同一反应体系中对mtDNA 12SrRNA基因A1555G、C1494T和961delT三个突变同时进行检测

3.7 利用分子开关，对50例志愿者的血液DNA样本的检测

第4章实 验 结 果

4.1 DNA的提取

4.2 利用分子开关在不同反应体系进行检测

4.3运用分子开关技术，在同一反应体系中对mtDNA 12S rRNA 基因A1555G、C1494T和961delT三个突变进行检测

4.4 分子开关技术在临床的应用

第5章实 验 讨 论

第6章 实验结论

参考文献

综述:线粒体12S rRNA突变与耳聋相关性研究进展

硕士期间研究成果

致谢