Notch基因转染体外培养的兔角膜内皮细胞调控其增殖分化的研究

摘要

本文旨在选出Notch家族成员中表达最强的基因，将该基因通过慢病毒载体介导转入体外培养的兔角膜内皮细胞中，研究转基因的兔角膜内皮细胞增殖及分化的转变，探讨运用转基因技术治疗角膜内皮细胞病的可能。通过撕取后弹力层法培养兔角膜内皮细胞；逆转录PCR扩增目的基因片段选出Notch家族各成员中表达最强的基因，构建重组慢病毒载体转染体外培养的的兔角膜内皮细胞，运用MTT法、免疫荧光、RT-PCR、倒置显微镜等方法观察记录兔角膜内皮细胞的增殖及分化情况。
　　撕取后弹力层体法可获得较纯净的单层兔角膜内皮细胞。Notch家族中的受体Notch2、Notch3及配体Delta1、Jagged1在兔角膜内皮细胞中有表达，且Notch3表达最强。慢病毒载体在MOI=100时，转染体外培养的兔角膜内皮细胞72h后其转染效率高达60％以上。
　　Notch3基因的转染使与内皮细胞分化相关的a-SMA、增殖相关的Ki-67基因的表达增强，细胞连接标志基因 ZO-1、N-cadherin的表达降低。慢病毒介导的Notch3基因可成功转入体外培养的兔角膜内皮细胞中并稳定表达，Notch3基因的过表达提高了Notch信号通路对兔角膜内皮细胞的增殖和分化的调控能力，该过程可被γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断。为转基因技术治疗角膜内皮细胞病提供了新思路。

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第一章 绪 论

第二章 材料与方法

1．实验材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂及配制

1.3 主要仪器设备

2.实验方法

2.2 细胞总RNA提取

2.3 转染效率检测

2.4 慢病毒转染

2.5 MTT法检测细胞增殖

2.6 real-time PCR

2.7 免疫荧光

3.统计学分析

第三章 实验结果

1.Notch 家族成员在兔角膜内皮细胞中的表达情况

2.慢病毒转染效率

3. 细胞形态学观察

4．MTT法检测兔角膜内皮细胞转基因前后增殖能力

5. 相关基因及蛋白表达水平的变化

第四章 讨 论

第五章 结 论

参考文献

综述:Notch信号通路调控内皮细胞增殖与分化的研究现状

硕士期间发表的论文

致谢