实验用主要仪器设备
主要试剂
前言
第一部分 人β-神经生长因子重组真核表达载体(pcDNA4-β-NGF)的构建
目的：
重组质粒构建图
质粒图谱
质粒阅读框
方法及结果：
一、人基因组DNA的提取
二、以人基因组DNA为模板，特异性扩增β-NGF基因全长序列
三、PCR产物的提纯
四、双酶切目的基因和pcDNA4B质粒DNA
五、酶切产物的纯化
六、酶切后产物（目的基因与质粒DNA）的体外连接
七、感受态细胞的制备（氯化钙化）、重组质粒的转染与筛选
八、抗氨苄青霉素JM109菌的DNA粗提取
九、酶切鉴定pcDNA4-β-NGF重组质粒
十、计算机自动化基因测序结果
十一、pcDNA4-β-NGF重组质粒的扩增及纯化
十二、总结性电泳
第二部分 猫角膜内皮细胞的体外培养及鉴定
目的：
材料及方法：
一.有关试剂
二.猫角膜内皮细胞的体外培养
三.体外培养的猫角膜内皮细胞的鉴定：
结果：
1、形态学观察结果
2、NSE免疫组织化学染色鉴定结果
3、透射电镜观察
第三部分 脂质体介导人β-NGF重组真核表达载体（pcDNA4-β-NGF）转染体外培养的猫角膜内皮细胞
目的
转染原理
步骤及方法
一、紫外分光光度仪检测质粒的纯度并调节其浓度
二、脂质体介导外源基因转染体外培养的猫角膜内皮细胞
三、转染效率的表达-报道基因的检测
四、通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）在基因水平检测人β-NGF基因的瞬时表达情况
五、免疫组织化学方法蛋白水平检测外源基因的表达
结果：
一、转染时细胞的形态变化
二、转染效率的检测
三、细胞总RNA的提取结果
四、RT-PCR结果
五、免疫组织化学结果
第四部分 人β-NGF基因转染体外培养猫角膜内皮细胞对其分裂再生的影响
目的：
步骤及方法：
一、MTT法检测猫角膜内皮细胞转基因前后细胞合成DNA能力
二、细胞有丝分裂指数分析转基因前后有丝分裂细胞为例
三、流式细胞术（FCM）检测转基因前后猫角膜内皮细胞中G1期细胞比例
四、人β-NGF基因促进猫角膜内皮细胞定量损伤愈合的研究
结果：
一、MTT检测结果
二、细胞有丝分裂指数分析结果
三、流式细胞仪检测的结果
四、人β-NGF基因促进猫角膜内皮细胞定量损伤的愈合
第五部分 稳定表达人β-NGF基因的猫角膜内皮细胞的筛选
目的：
步骤及方法：
一、角膜内皮细胞的G418最小致死剂量测定
二、抗性细胞克隆的筛选
三、人β-NGF单克隆抗体的免疫组织化学染色
结果：
一、角膜内皮细胞G418最小致死剂量测定
二、抗性细胞克隆的筛选
三、人β-NGF单克隆抗体的免疫组织化学染色结果
讨论：
参考文献
结论：
综述 角膜内皮细胞移植的相关研究进展
博士在读期间已发表和待发表的文章
致谢
