雷帕霉素对人外周血B细胞IM-9增殖和产生IgG/IgM抗体的影响

摘要

目的：观察不同浓度雷帕霉素（Rapamycin）对人外周血B淋巴细胞（IM-9）IgG、IgM产生的影响；探讨Rapamycin抑制B淋巴细胞产生血型抗体的可能机制，为临床ABO血型不相容器官移植免疫抑制方案的应用提供实验依据。
　　方法：①ELISA检测Rapamycin对IM-9细胞IgG，IgM产生的影响。将相同浓度的IM-9细胞接种于6孔板，设空白对照组、DMSO组、Rapamycin25、50、100nmol/L组、硼替佐米阳性对照组6组。分别加入PWM刺激B细胞产生抗体，于PWM刺激3天及5天后分别向各孔加入不同浓度药物作用24h后，离心收集细胞上清液，用ELISA方法测出各组产生IgG，IgM的量；②流式检测各组表达CD19、CD38的B细胞转化率。将相同浓度的细胞接种于6孔板上，待细胞浓度达到109后，加入PWM刺激3天后分别向各孔加入不同浓度的Rapamycin及硼替佐米，作用24h后，以CD19、CD38抗体标记，固定，流式细胞仪测出各组细胞中CD19、CD38标记细胞的比例；③CCK8法观察Rapamycin对B淋巴细胞（IM-9）的增殖抑制作用。设 Rapamycin12.5、25、50、100、200nmol/L五个浓度组、DMSO溶媒对照组、空白对照组，通过酶标仪测出药物作用24h、48h的OD值，分别绘制出不同Rapamycin浓度和作用时间与抑制率Rapamycin关系图；④流式检测药物作用后的细胞周期比和凋亡率。将同密度的细胞接种于6孔板，待细胞数量达到109后，分别向各孔加入不同浓度Rapamycin、DMSO和硼替佐米，24h后收集细胞，离心固定，PI染色，流式细胞仪测出各组细胞的细胞周期和凋亡率；⑤PCR检测Rapamycin对Bax、Bcl-2基因表达的影响。所有结果应用SPSS18.0软件进行统计学分析。
　　结果：①Rapamycin对B细胞产生IgG、IgM抗体有一定抑制作用，其对IM-9细胞产生IgG的抑制作用明显，且抑制程度与Rapamycin有着显著的剂量依赖性；对 IgM的抑制作用较弱，需 Rapamycin浓度达到50nmol/L时与对照组相比方有统计意义（P＜0.05），并且其对IgM的抑制作用与Rapamycin的浓度增加未见明显的相关性，Rapamycin50nmol/L与100nmol/L组对比，无明显差异（P＞0.05）；②流式检测CD19、CD38，加入PWM刺激IM-9细胞3天后，其中细胞主要表现为CD19（+）、CD38（+）双阳性的浆母细胞，各实验组随着Rapamycin浓度的增加，浆母细胞的比例下降，与对照组相比具有统计学意义（P＜0.05）；③CCK8：随着Rapamycin浓度的升高和时间延长，其对IM-9细胞的增殖抑制也逐步上升，其中Rapamycin浓度为200nmol/L作用48小时的时候对IM-9细胞的抑制作用最高；各实验组与对照组相比有明显差异（P＜0.05）；④Rapamycin浓度为25、50、100nmol/L处理组较对照组，G1期细胞比例明显增加，有显著差异（P＜0.05）；⑤PCR实验，Rapamycin各组BCL-2表达较对照组明显下调，而Bax表达无明显差异。
　　结论：①Rapamycin能抑制B细胞向浆母细胞转化从而抑制B细胞IgG、IgM抗体产生；②Rapamycin可能是通过将B细胞阻滞于G1期，使其生长停滞，抑制其增殖；同时Rapamycin可能通过下调Bcl-2基因的表达，促进B细胞的凋亡。

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目录

第1章 绪论

第2章 材料与方法

2.1、实验材料

2.2、实验方法

2.3 统计学分析

第3章 实验结果

1.ELISA测IM-9细胞产生的IgG和IgM

2．流式细胞仪检测细胞CD19、CD38表达

3．Rapamycin对IM-9细胞的增殖抑制作用

4.流式细胞仪检测细胞周期

5.PCR检测Bcl-2、Bax表达

第4章 讨论

1.雷帕霉素能直接作用于B细胞抑制其产生抗体

3.雷帕霉素能通过抑制浆母细胞从而抑制抗体的产生

1.雷帕霉素对IM-9细胞的体外增殖有一定的抑制作用

4.雷帕霉素能下调Bcl-2基因的表达

5.总结与展望

第5章 结论

参考文献

文献综述:ABO血型不相容肾移植的利弊及发展前景

主要缩略英文索引

硕士期间发表的论文

致谢