常见药用植物内生菌根真菌抑菌活性及分子生物学的初步研究

摘要

随着人们对药用植物内生菌根真菌研究的深入，越来越多的药用植物内生菌根真菌的次生代谢产物被分离鉴定，并被证明其中含有与宿主植物相同或相似的有效成分。研究药用植物内生菌根真菌的活性成分、为药用植物资源寻找合理的替代品已成为当今药用植物研究的热点问题之一。本实验通过对药用植物内生菌根真菌的研究，为其成为药用植物合理的替代品提供了基础数据。 本实验利用组织分离的方法，从常见的16种药用植物的根部分离得到了11株内生菌根真菌。并对其中的5个菌株进行了生物学特陛、抑菌活性、有效化学成份及分子生物学等方面了研究。 供试的5个菌株分别为：分离自桔梗中的内生菌根真菌JG1102，分离自防风中的内生菌根真菌FF0121，分离自苦参中的内生菌根真菌KS1220，分离自玉竹中的内生菌根真菌YZ1104，分离自黄芩的内生菌根真菌nQin0116。其中，可以通过形态学，即分生孢子的形态特征进行鉴定的有4株。即桔梗内生菌根真菌JG1102初步鉴定为桔梗链格孢(Alternaria platycodonis)，防风内生菌根真菌FF0121根链格孢(Alternaria radicina)，苦参内生菌根真菌KS1220豆链格孢(Alternaria azukiea)，玉竹内生菌根真菌YZ1104初步鉴定为燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)本实验分别从5种不同的碳源和氮源中，筛选出适宜菌株JG1102、FF0121、KSl220、YZ1104和lHQin0116生长的碳源和氮源。综合实验结果，并本着节约成本的原则，我们分别选择了葡萄糖和马铃薯作为内生菌根真菌培养中的最佳碳源和氮源，即在供试的内生菌根真菌的培养中，利用马铃薯葡萄糖(PDA)培养基就可以达到最佳的效果。在最适生长温度的研究中，本实验确定了20～25℃为内生菌根真菌的最适温度。 从供试的5个菌株中筛选出了3株具有抑制细菌活性的菌株，分别为JG1102、YZ1104和HQin0116。抑菌结果表明，此3个菌株的发酵产物、甲醇提取液、乙醇提取液对细菌均有一定的抑菌活性，并且甲醇提取液的抑菌率较乙醇提取液的抑菌率略高。但这3个菌株的水提液对测试细菌则都没有抑菌活性。 通过薄层层析色谱的分析，分别用黄酮展开剂CHCl<,3>:MeOH(8.5:1.5)和生物碱展开剂CHCl<,3>:MeOH(7:1)(加少量氨水和二乙胺)薄层展开后，10％的浓硫酸显色，观察荧光和显色斑点。结果表明：菌株JG1102、YZ1104和HQin0116与其宿主原植物含有相同或相似生物碱和黄酮类的有效成分。 以ITS1和ITS4为引物，对KS1220的rDNA进行了PCR扩增，并对扩增产物进行了测序，结果表明：这种内生菌根真菌与已有的土壤真菌的同源相似性较高。 本文的创新点： 本实验首次采用组织分离和形态学鉴定的方法，确定了桔梗内生菌根真菌JG1102为桔梗链格孢，防风内生菌根真菌FF0121为根链格孢，苦参内生菌根真菌KS1220位为链格孢，玉竹内生菌根真菌YZ1104为燕麦镰孢菌。 本实验首次筛选出了3株具有抑制细菌活性的内生菌根菌株，分别为桔梗内生菌根真菌JG1102(桔梗链格孢)、玉竹内生菌根真菌YZ1104(燕麦镰孢菌)和黄芩内生菌根真菌HQin0116。并通过化学成分的初步检验，证明了这3个菌株与其宿主原植物含有相同或相似的生物碱和黄酮类有效成分。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章研究进展

1.1菌根菌的研究现状

1.1.1菌根菌的种类

1.1.2菌根的微观特征

1.2内生菌根菌的效应及其作用机制

1.2.1内生菌根菌与植物的矿质营养

1.2.2内生菌根菌与植物的水分状况

1.2.3内生菌根菌与植物的抗病性

1.2.4内生菌根菌与植物的其他抗逆性

1.2.5内生菌根菌对土壤有机污染物的生物降解

1.3菌根菌与其宿主植物含有相同或相似的活性成分

1.4分子生物学在菌根菌研究中的应用

1.5内生菌根菌对药用植物的影响

1.5.1人参中的内生菌根真菌

1.5.2兰科植物中的内生菌根菌

第二章菌根真菌的分离鉴定

2.1实验材料与仪器

2.1.1实验材料

2.1.2仪器设备

2.1.3培养基的制备

2.2实验方法

2.2.1内生菌根真菌的分离与纯化

2.2.2菌种的鉴定

2.3结果与讨论

2.3.1桔梗内生菌根真菌JG1102-桔梗链格孢

2.3.2防风内生菌根真菌FF0121-根链格孢

2.3.3苦参内生菌根真菌KS1220-豆链格孢

2.3.4玉竹内生菌根真菌YZ1104-燕麦镰孢

第三章培养条件的研究

3.1实验材料与仪器

3.1.1实验材料

3.1.2实验仪器

3.2实验方法

3.2.1固体培养基中碳源的选择

3.2.2固体培养基中氮源的选择

3.2.3培养温度对菌丝体的影响

3.3结果与分析

3.3.1固体培养基中碳源的确定

3.3.2固体培养基中氮源的确定

3.3.3固体培养基培养温度的确定

3.4小结与讨论

第四章抑菌活性及化学成分的初步研究

4.1实验材料、仪器与试剂

4.1.1实验材料

4.1.2仪器设备

4.1.3试剂

4.2实验方法

4.2.1抑菌活性的初步研究

4.2.2化学成分的初步检验

4.3结果与分析

4.3.1抑菌实验结果

4.3.2薄层色谱分析

4.4小结与讨论

4.4.1抑菌活性的筛选

4.4.2化学成分的初步检验

第五章分子生物学研究

5.1实验材料、仪器与试剂

5.1.1实验材料

5.1.2仪器设备

5.1.3试剂

5.2实验方法

5.2.1所需试剂的配制

5.2.2 rDNA的提取及检验

5.2.3 PCR扩增

5.2.4 PCR扩增产物的克隆

5.2.5 PCR克隆产物的序列测定

5.2.6数据分析

5.3结果与分析

5.3.1苦参内生菌根真菌rDNA的提取

5.3.2苦参内生菌根真菌PCR扩增结果

5.3.3苦参内生菌根真菌PCR产物克隆结果

5.3.4序列分析

5.4小结与讨论

第六章结论与讨论

6.1结论

6.2讨论

6.3创新点

参考文献

致谢

作者简介