WNT5A/Ror2通过PKC信号通路下调CyclinD1的表达抑制血管平滑肌细胞增殖

摘要

目的：观察WNT5A对血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖的影响，继而探讨WNT5A及其信号通路抑制血管平滑肌细胞增殖的作用机制。
　　方法：采用慢病毒载体构建稳定过表达WNT5A的VSMCs细胞株。采用MTT，平板克隆以及Edu等方法检测WNT5A对VSMCs增殖的影响。流式细胞术检测WNT5A对细胞周期的影响。免疫荧光和免疫共沉淀验证WNT5A和Ror2的空间共定位以及结合情况。MTT，平板克隆，Edu以及流式细胞术等方法检测siRNA敲低Ror2对VSMCs增殖。采用Western-blot检测WNT5A/Ror2/PKC/P53/CyclinD1信号通路等相关蛋白的表达。
　　结果：
　　1）WNT5A在血清培养条件下的VSMCs中的表达明显降低，且呈时间依赖性。过表达和外源性重组WNT5A抑制VSMCs的增殖。siRNA敲低WNT5A能够促进VSMCs的增殖。
　　2）WNT5A能上调P53，下调CyclinD1的表达进而抑制VSMCs细胞周期G0向G1期的转化。
　　3）WNT5A能上调受体Ror2的表达，并且WNT5A与Ror2之间存在空间共定位，并相互结合。siRNA敲低Ror2后，WNT5A对VSMCs增殖的抑制出现逆转。同时，敲低Ror2后VSMCs周期G0/G1期的比例降低，P53的表达减少，CyclinD1的表达增多。
　　4）WNT5A能增加PKC的磷酸化水平，siRNA敲低Ror2后PKC的磷酸化水平降低。采用PKC激动剂PMA处理VSMCs，WNT5A和P53的表达明显升高，而CyclinD1则表达下调。采用PKC抑制剂GF10923X处理VSMCs，WNT5A和P53的表达下调，CyclinD1的表达上调。
　　结论：
　　1）WNT5A抑制体外血清培养的VSMCs的增殖。
　　2）WNT5A通过阻滞G0/G1期从而抑制VSMCs增殖，其机制可能与上调P53和下调CyclinD1的表达相关。
　　3）Ror2介导了WNT5A对VSMCs增殖的抑制作用。
　　4）WNT5A/Ror2可能通过激活PKC通路，介导了P53的表达上调和CyclinD1的表达下调，从而抑制VSMCs增殖。且WNT5A与PKC之间也存在正反馈调控作用，即WNT5A在激活PKC的同时，被激活的PKC反过来可上调WNT5A的表达。

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主要实验仪器

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英文摘要

第一章 前 言

第二章 WNT5A对VSMCs增殖的影响

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1试剂与材料

2.2.2方法与步骤

2.3 结果与分析

2.3.1 WNT5A在血清培养条件下VSMCs中的表达

2.3.2稳定过表达WNT5A细胞株的验证

2.3.3过表达WNT5A对VSMCs生长和增殖的影响

2.3.4外源性重组WNT5A对VSMCs生长和增殖的影响

2.3.5 小分子干扰VSMCs中WNT5A的验证

2.3.6小分子干扰WNT5A对VSMCs生长和增殖的影响

2.3.7WNT5A对VSMCs增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen, PCNA）表达的影响

2.4 讨论与结论

2.4.1 讨论

2.4.2 结论

第三章 WNT5A对VSMCs增殖影响的作用机制研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 试剂与材料

3.3 结果与分析

3.3.1 WNT5A对VSMCs细胞周期的影响

3.3.2 WNT5A对细胞周期相关蛋白及其调控蛋白的影响

3.3.3 WNT5A通过与其受体 Ror2 的作用抑制VSMCs的增殖

3.4 讨论与结论

3.4.1 讨论

3.4.2 结论

参考文献

综述: Wnt5a及其信号通路与血管新生的研究进展

硕士期间发表的论文

致谢