MiR-27抑制巨噬细胞LPL表达减轻ApoE-/-小鼠As病变程度

摘要

动脉粥样硬化（Atherosclerosis,As）是以脂质代谢紊乱为特征的慢性炎症性病理改变，由此引发的心脑血管疾病严重危害人类健康，已成为当前全球亟待解决的首要健康问题之一。其中，动脉血管壁内巨噬细胞浸润所致炎症因子大量分泌以及脂质的过度蓄积是其核心环节。如何有效控制这一病理过程，对As性心脑血管疾病的防治起到十分关键的作用。
　　在转录后水平，单链非编码microRNAs（miRNAs）与靶基因mRNA的3’非翻译区（3’-untranslated regions，3’UTR）配对结合，调控心血管疾病相关基因的表达，已经成为As性心血管疾病重要的防治策略。人类microRNA-27（miR-27）的两个亚型miR-27a和miR-27b分别位于19号和9号常染色体上。目前发现，miR-27与As相关的多种危险因素如肥胖、血管新生、免疫炎症的调节密切相关，能有效抑制脂肪细胞的分化与成熟，参与肝脏对异常血脂的调节，降低过敏性炎症的发生，影响脂质代谢和炎症反应。有研究者在对LPS诱导的巨噬细胞炎症相关miRNAs谱的检测中发现miR-27a表达明显下调，与本研究预实验发现经氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）孵育的THP-1巨噬细胞内miR-27a/b的表达下调现象一致，提示其可能是一类具有As保护效应的miRNA，但具体机制尚未阐明。
　　因此，有必要阐明miR-27对巨噬细胞炎症因子分泌及脂质代谢的影响，为揭示miR-27的抗As作用与机制提供理论依据。在动物实验中发现 miR-27a/b减少血浆低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoproteincholesterol，LDL-C）的同时，升高甘油三酯（triglyceride,TG），降低游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）水平，推测此现象与其调控甘油三酯脂酶有关。
　　甘油三酯脂酶基因家族成员主要包括脂蛋白脂酶（Lipoprotein lipase，LPL）、内皮脂酶（Endothelial lipase,EL）、胰脂酶（pancreatic lipase,PL）和肝脂酶（Hepatic lipase,HL），其中，血浆中的LPL是水解脂蛋白核心TG的关键限速酶，而位于巨噬细胞表面的LPL则具有“促炎摄脂”功能。研究表明，家族性高胆固醇血症患者体内及冠状动脉粥样硬化患者病灶中巨噬细胞LPL呈高表达状态。动物模型中特异性敲除巨噬细胞源性LPL，可以明显缓解As病变，而特异性高表达巨噬细胞中的LPL，则促进主动脉斑块形成。提示巨噬细胞源性 LPL可通过其“分子桥”作用促进对脂质的摄取，使胞内脂质过度蓄积；同时增加炎症因子分泌，加速As病变的形成。因此，寻找有效的调控措施，降低巨噬细胞内LPL表达，将为确立巨噬细胞LPL的致As作用以及对As性疾病的防治提供新的思路。
　　KLF基因家族成员中的转录因子Kruppel样因子14（Kruppel-like factor14，KLF14）在调控血脂、肥胖、糖尿病、冠心病等动脉粥样硬化相关疾病中发挥十分重要的作用。全基因组关联研究（Genome-wide association studies,GWAS）发现KLF14能调节血浆HDL、LDL、TG等血质水平，其等位基因突变与动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）的发生密切相关。目前，KLF14的研究多集中在肝脏的调脂作用，而是否参与炎症调节以及抗动脉粥硬化的具体机制尚不清楚，因此，进一步探讨KLF14在肝外对巨噬细胞炎症及脂质调节，可为动脉粥硬化的防治提供新的干预途径和药物作用靶点。
　　生物信息学技术预测发现miR-27a/b具有靶向结合LPL mRNA3’UTR的生物学基础，并通过预实验证实miR-27a/b的确可以下调THP-1巨噬细胞LPL的表达。此外，我们发现转录因子KLF14可上调miR-27a的表达，且生物信息学结果显示miR-27a启动子存在KLF14的结合位点。由此，本研究提出”miR-27通过直接靶向结合LPL mRNA的3’UTR，沉默其表达，进而抑制巨噬细胞炎症因子分泌和脂质蓄积；转录因子KLF14激活miR-27a启动子，上调其表达，抗As发生发展”的研究假说。为此，本研究设计了四部分实验来论证此假说。首先，用ox-LDL孵育巨噬细胞，检测miR-27a/b的表达，并利用模拟物（mimic）或抑制剂（inhibitor）高表达或沉默巨噬细胞中miR-27a/b，观测其对细胞炎症因子分泌及脂质蓄积的影响。接着，以高脂饮食喂养的apoE-/-小鼠为动物模型，尾静脉注射miR-27a/b agomir或miR-27a/b antagomir，观测小鼠As病变范围、主动脉壁脂质蓄积程度、血脂及炎症因子水平，以期进一步证实miR-27a/b的抗As效应；然后，采用生物信息学预测和荧光素酶报告基因验证miR-27a/b是否与 LPL3’UTR靶向结合并抑制该基因表达；体外及体内实验观测过表达或沉默LPL后，miR-27a/b对炎症因子分泌及脂质蓄积的影响，并检测炎症核转录因子（nuclear factor-kappa B,NF-κB）磷酸化水平及细胞表面清道夫受体CD36、SR-A1、LOX-1、CXCL16表达情况，初步探讨miR-27a/b的抗As机制以及巨噬细胞LPL在As发生发展中的作用；最后，利用生物信息学、染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）以及荧光素酶报告基因等技术，通过细胞及动物实验证实绞股蓝皂甙（Gypenoside,GP）通过KLF14/miR-27a途径下调LPL的表达，抑制巨噬细胞炎症因子分泌及脂质蓄积，揭示GP抗As病变的作用及机制。
　　第一部分 MiR-27抑制巨噬细胞炎症因子分泌及脂质蓄积
　　目的：
　　观察miR-27a/b在ox-LDL孵育的巨噬细胞内的表达变化；明确miR-27a/b对ox-LDL处理的巨噬细胞炎症因子分泌及胞内脂质蓄积的影响。
　　方法：
　　1.将人源性THP-1和小鼠源性RAW264.7单核细胞诱导分化成巨噬细胞，ox-LDL处理48 h，实时定量PCR（qRT-PCR）检测miR-27a/b的表达；
　　2.miR-27a/b mimic或 miR-27a/b inhibitor分别转染至THP-1或RAW264.7巨噬细胞中，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养基中白细胞介素-1β（interleukin-1beta,IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）的水平；
　　3.采用Dil-ox-LDL结合实验检测细胞摄取ox-LDL的能力；
　　4.高效液相色谱法（HPLC）检测巨噬细胞内总胆固醇（total cholesterol,TC）、游离胆固醇（free cholesterol,FC）和胆固醇酯（cholesterol ester,CE）的含量；
　　结果：
　　1.用50μg/ml的ox-LDL分别孵育THP-1与RAW264.7巨噬细胞48 h，实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR）检测结果显示miR-27a/b的表达水平显著下调；
　　2.ELISA结果显示，巨噬细胞转染miR-27a/b mimic后，巨噬细胞IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α的分泌明显减少，而转染 miR-27 a/b inhibitor上述炎症因子反之显著增加；
　　3.Dil-oxLDL结合实验显示 miR-27a/b mimic明显抑制巨噬细胞对ox-LDL的摄取，而miR-27a/b inhibitor则促进细胞摄取ox-LDL；
　　4.HPLC检测发现miR-27a/b mimic使巨噬细胞内TC及CE含量显著减少，而miR-27a/b inhibitor则使胞内TC及CE含量增加。
　　结论：
　　1.miR-27a/b减少巨噬细胞炎症因子的分泌；
　　2.miR-27a/b可通过抑制巨噬细胞脂质摄取，降低TC及CE含量，从而减少胞内脂质蓄积。
　　第二部分 MiR-27减轻apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变程度
　　目的：
　　观测miR-27a/b对apoE-/-小鼠As病变范围、主动脉壁脂质蓄积程度、血脂及血浆炎症因子水平的影响。
　　方法：
　　1.将60只8周龄雄性apoE-/-小鼠随机分为6组：miR-27a/b agomir negative control（AG-NC）组、miR-27a agomir（AGa）组、miR-27b agomir（AGb）组、miR-27a/b antagomir negative control（AN-NC）组、miR-27a antagomir（ANa）组、miR-27b antagomir（ANb）组，每组10只，其中，AGa/AGb或ANa/ANb组每4周经尾静脉注射80 mg/kg剂量的miR-27a agomir/miR-27b agomir或miR-27a antagomir/miR-27b antagomir，经高脂高胆固醇饮食喂养8周后麻醉处死取材待检；
　　2. qRT-PCR检测miR-27a/b在主动脉中的表达情况；
　　3.体视显微镜下观察主动脉弓及三大分支As病变形成情况；
　　4.油红”O”染色观测主动脉血管壁及主动脉窦As病变部位蓄脂情况；
　　5.苏木素/伊红染色（HE）观测小鼠主动脉窦AS病变程度；
　　6.Masson氏染色法检测As病变处胶原纤维的含量；
　　7.ELISA法检测血浆中炎症因子水平；
　　8.全自动生化分析仪检测血浆TG、TC、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、LDL-C的水平。
　　结果：
　　1.miR-27a agomir和miR-27b agomir能分别上调主动脉中miR-27a和miR-27b的表达；而miR-27a antagomir和miR-27b antagomir则明显下调主动脉miR-27a和miR-27b的表达；
　　2.体视显微镜及油红”O”染色观察发现AGa和AGb组小鼠主动脉及分支As病灶形成有所减少，而ANa和ANb组小鼠此处斑块较AN-NC组增加；
　　3.HE染色结果显示，AGa和AGb组小鼠主动脉窦As病变面积明显减少，而ANa和ANb组小鼠则明显增加；
　　4.主动脉窦经油红O染色显示，AGa和AGb组小鼠与AG-NC组相比主动脉窦处的红染区面积明显缩小，病变脂质蓄积减少；而与AN-NC组相比，ANa和ANb组小鼠主动脉窦处的病变部位脂质蓄积明显增加；
　　5.小鼠主动脉窦胶原纤维经Masson三色染色后显示，AGa和AGb组病变处胶原纤维含量较AG-NC组显著减少；与AN-NC组相比，ANa和ANb组则明显增加；
　　6.采用ELISA法检测结果显示，与AG-NC对照组相比，AGa和AGb组小鼠血浆IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α水平明显降低，而ANa和ANb组小鼠血浆上述炎症因子水平较AN-NC组显著升高；
　　7.全自动生化分析仪检测显示，AGa和AGb组小鼠血浆TC及LDL-C水平较AG-NC对照组明显降低，而TG水平升高；与AN-NC对照组相比，ANa和ANb组小鼠TC、LDL-C水平则明显升高，TG水平却降低。
　　结论：
　　1.miR-27a/b减少apoE-/-小鼠As病变程度；
　　2.miR-27a/b可降低apoE-/-小鼠血浆炎症因子分泌及胆固醇水平。
　　第三部分 MiR-27抑制LPL减少巨噬细胞炎症因子分泌及脂质蓄积
　　目的：探讨miR-27是否靶向结合LPL mRNA的3’UTR，抑制其表达；过表达或沉默LPL，miR-27对巨噬细胞炎症因子表达及脂质蓄积的影响及其机制。
　　方法：
　　1.利用多个开放数据库及在线软件等生物信息学方法明确不同物种miR-27a/b成熟碱基序列及保守性、LPL3’UTR序列，预测miR-27a/b潜在靶标基因、分析miR-27a/b与LPL mRNA的靶向结合区域及位点，预测其结合评分及自由能，并模拟构建二维茎环结构模型；
　　2.将miR-27a/b mimic与野生型/突变型LPL mRNA的3’UTR报告基因载体共转染至HEK293T细胞，采用荧光素酶报告基因法检测miR-27a/b与LPL mRNA的3’UTR靶向结合能力；
　　3.将miR-27a/b mimic或miR-27a/b inhibitor及其对照转染到THP-1和小鼠RAW264.7细胞中，qRT-PCR和蛋白质免疫印迹（Western blot）法检测LPL的mRNA及蛋白水平，试剂盒检测巨噬细胞培养液中LPL的活性；
　　4.qRT-PCR和Western blot法检测apoE-/-小鼠MPM和主动脉组织中LPL mRNA和蛋白的表达；
　　5.采用免疫荧光双标技术检测 LPL在 apoE-/-小鼠主动脉窦斑块中的表达以及与巨噬细胞共定位情况；
　　6.采用小RNA（siRNA）干扰技术或加入牛源性LPL，抑制或增加THP-1巨噬细胞LPL，通过ELISA和HPLC方法检测细胞培养基炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平以及巨噬细胞内TC、FC和CE含量，以探讨miR-27a/b是否是通过靶向调控LPL影响巨噬细胞炎症因子分泌和脂质蓄积；
　　7.Western blot法检测巨噬细胞和apoE-/-小鼠MPM中NF-κB表达及磷酸化水平，探讨miR-27a/b的抗炎机制；
　　8.qRT-PCR和Western blot法检测巨噬细胞与apoE-/-小鼠MPM表面清道夫受体CD36、SR-A1、LOX-1、CXCL16的mRNA及蛋白的表达水平，以期证实LPL参与miR-27a/b对清道夫受体表达的调控，探讨miR-27a/b抑制巨噬细胞脂质摄取机制。
　　结果：
　　1.通过数据库获取miR-27a/b成熟碱基序列及LPL的mRNA3’UTR序列信息后，运用生物信息学技术预测及分析发现miR-27a/b在物种进化过程中高度保守，且存在精确调控靶基因的一致性和可靠性，同时多个靶标预测网站发现miR-27a/b具有靶向结合LPL mRNA3’UTR的生物学基础。
　　2.miR-27a/b mimic与野生型LPL mRNA的3’UTR报告基因载体共转染至HEK293T细胞后检测发现荧光素酶活性与mimic-neg对照组相比显著降低，而miR-27a/b mimic与突变型3’UTR报告基因载体共转染后发现位点2突变组（SDM2）及双位点突变组（SDM1+2）荧光素酶活性与对照组（control）相比无并明显差异（P＞0.05）；而位点1突变组（SDM1）与野生型组（WT）荧光素酶活性却较对照组显著降低；
　　3.通过qRT-PCR、Western blot法及试剂盒检测，结果显示转染miR-27a/b mimic能抑制THP-1和RAW264.7细胞LPL的mRNA和蛋白表达，降低细胞LPL活性，而miR-27a/b inhibitor增加其表达和活性；
　　4.qRT-PCR和Western blot结果显示，AGa和AGb组 apoE-/-小鼠MPM和主动脉组织中LPL mRNA和蛋白表达较AG-NC对照组明显降低；ANa和ANb组小鼠LPL表达则显著增加；
　　5.免疫荧光双标技术检测表明主动脉窦巨噬细胞浸润区域与LPL表达区高度一致，且AGa与AGb组小鼠As病变处荧光强度较AG-NC对照组明显减弱，巨噬细胞浸润减少，LPL表达下调，而ANa与ANb组中小鼠主动脉窦中巨噬细胞浸润及LPL表达则显著增加；
　　6.在转染miR-27a/b inhibitor基础上进行LPL siRNA干扰可逆转miR-27a/b inhibitor增加巨噬细胞炎症因子水平的趋势，使炎症因子分泌水平恢复到对照组水平；
　　7.THP-1巨噬细胞转染 miR-27a/b mimic或 miR-27a/b inhibitor后，各组细胞中NF-κB表达均无明显差异，而miR-27a/b mimic组NF-κB磷酸化水平则较control对照组降低，反之，miR-27a/b inhibitor组NF-κB磷酸化水平则升高，在转染miR-27a/b inhibitor基础上进行LPL siRNA干扰可逆转miR-27a/b inhibitor增加NF-κB磷酸化水平的趋势，同时，检测了各组 apoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞 NF-κB磷酸化水平，显示与AG-NC对照组相比，AGa和AGb组NF-κB磷酸化水平较对照组降低，而ANa和ANb组则显著升高；
　　8.HPLC法检测显示，外源性加入LPL将增加巨噬细胞中TC、FC和CE含量，当细胞转染LPL siRNA后巨噬细胞中脂质水平则明显降低，在 miR-27a/b inhibitor转染基础上进行LPL siRNA干扰可逆转miR-27a/b inhibitor增加巨噬细胞内脂质水平的趋势；
　　9.转染miR-27a/b mimic或miR-27a/b inhibitor至THP-1巨噬细胞内，qRT-PCR和Western blot检测发现miR-27a/b mimic能下调THP-1巨噬细胞CD36、SR-A1、LOX-1及CXCL16清道夫受体mRNA及蛋白的表达，而miR-27a/b inhibitor则上调其表达，而在转染miR-27a/b inhibitor基础上，siRNA技术沉默LPL表达可逆转miR-27a/b inhibitor上调清道夫受体表达的趋势；
　　10.qRT-PCR及Western blot法检测结果显示，AGa和AGb组apoE-/-小鼠MPM表面CD36、SR-A1、LOX-1及CXCL16受体的mRNA及蛋白表达较AG-NC对照组明显减低，而与AN-NC对照组相比，ANa和ANb组则显著增加。
　　结论：
　　1.miR-27a/b通过靶向结合LPL mRNA的3’UTR，抑制LPL mRNA和蛋白表达；
　　2.miR-27a/b通过靶向抑制LPL表达，负性调节巨噬细胞转录因子NF-κB的磷酸化水平以及清道夫受体 CD36、SR-A1、LOX-1、CXCL16的表达，减少巨噬细胞炎症因子分泌和脂质蓄积。
　　第四部分 GP通过KLF14下调miR-27a抑制LPL表达减轻As病变
　　目的：
　　通过观测绞股蓝皂甙（GP）对巨噬细胞KLF14（Kruppel-like factor14）、miR-27及LPL表达和apoE-/-小鼠As病变、血浆炎症因子及脂质水平的影响，探讨绞股蓝皂甙是否通过KLF14/miR-27a途径下调LPL，抑制炎症因子分泌和脂质蓄积，发挥抗As的作用。
　　方法：
　　1.采用四甲基偶氮唑盐比色法（MMT）及试剂盒分别检测细胞活性及细胞释放乳酸脱氢酶（LDH）的变化，以探讨GP是否有细胞毒性；
　　2.ox-LDL处理THP-1巨噬细胞，并以不同浓度（0，10，25，50，100μg/mL）经48 h或不同时间（0、6、12、24、48 h）50μg/ml的GP孵育THP-1巨噬细胞，并利用qRT-PCR和Western blot技术检测THP-1及RAW264.7巨噬细胞LPL的mRNA及蛋白表达水平；
　　3.将内源性感染LPL过表达慢病毒载体或外源性加入牛源性 LPL后的THP-1巨噬细胞与50μg/ml的GP共孵育，利用ELISA法检测细胞培养基中炎症因子的水平，HPLC法观测GP对胞内脂质的影响；
　　4.50μg/ml的GP巨噬细胞共孵育24 h，qRT-PCR检测GP对巨噬细胞miR-27水平的影响；
　　5.将miR-27a inhibitor转染至巨噬细胞，经GP孵育细胞24 h后，qRT-PCR及Western blot检测GP对巨噬细胞LPL mRNA及蛋白表达的影响，ELISA检测miR-27a/LPL对GP调控巨噬细胞炎症因子分泌的影响，HPLC法及油红O染色检测 miR-27a/LPL对GP对THP-1巨噬细胞脂质含量的影响；
　　6.qRT-PCR及Western blot检测GP对巨噬细胞转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α（CCAAT/enhancer binding protein，KLF14）的mRNA或蛋白表达及miR-27a前体（pre-miR-27a）的影响；
　　7.采用siRNA干扰技术或将人源性KLF14过表达的慢病毒载体感染THP-1巨噬细胞，过表达或沉默THP-1巨噬细胞KLF14，qRT-PCR检测pre-miR-27a的表达，探讨GP是否是通过KLF14调控miR-27a；
　　8.人源性KLF14过表达的慢病毒载体感染的THP-1巨噬细胞与5μg/ml的放线菌素D共孵育24 h，qRT-PCR检测KLF14和miR-27a前体（pre-miR-27a）表达；
　　9.生物信息学预测KLF14与miR-27a启动子结合的能力及靶点序列；
　　10.采用ChIP及荧光素酶报告基因检测技术验证KLF14与miR-27a启动子靶向结合作用；
　　11.将40只8周龄雄性apoE-/-小鼠随机分为4组，每组10只：对照组（CON组）、Gypenoside组（GP组）、Gypenoside+miR-27a antagomir组（GP+ANa组）、Gypenoside+ human LPL lentiviral vector组（ GP+LV-hLPL组），其中GP+ANa组和GP+LV-hLPL组小鼠在给予200 mg/kg/d GP灌胃的同时，每4周经尾静脉注射80 mg/kg剂量的miR-27a antagomir（ANa）或6×107TU（200ul）的人源性LPL慢病毒载体（LV-hLPL），经高脂高胆固醇饮食喂养8周后麻醉处死取材待检；体视显微镜下观察主动脉弓及三大分支As病灶形成情况；油红O染色观测主动脉血管壁及主动脉窦As病变部位蓄脂情况；HE观测小鼠主动脉窦As病变程度；Masson氏染色法检测As病变处胶原纤维的含量；ELISA法检测血浆中炎症因子水平；全自动生化分析仪检测血浆TG、TC、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、LDL-C的水平。
　　结果：
　　1.巨噬细胞活性及培养基LDH水平检测发现GP无巨噬细胞毒性，可行进一步实验；
　　2.GP呈剂量和时间依赖性下调THP-1巨噬细胞LPL mRNA及蛋白表达，同时也可下调RAW264.7巨噬细胞LPL的表达；
　　3.将内源性感染LPL过表达慢病毒载体或外源性加入LPL后的THP-1巨噬细胞与50μg/mL绞股蓝皂甙共孵育，检测发现，与GP组比较，在孵育GP基础上，THP-1巨噬细胞感染LPL过表达慢病毒载体可逆转绞股蓝皂甙减少巨噬细胞炎症因子分泌的趋势，使炎症因子分泌水平接近对照组水平，而在培养基中加入牛源性LPL后，则可完全逆转绞股蓝皂甙抗细胞炎症效应；
　　4.在孵育GP基础上，THP-1巨噬细胞感染LPL过表达慢病毒载体或在培养基中加入牛源性LPL均可逆转GP减少巨噬细胞TC、FC及CE及脂质蓄积的趋势；
　　5.GP明显上调经ox-LDL处理的THP-1巨噬细胞中miR-27a的表达，如将miR-27a inhibitor（27a-Inh）转染至巨噬细胞后，可明显减弱GP对LPL表达的抑制作用，上调LPL mRNA及蛋白水平，且能逆转GP减少巨噬细胞炎症因子分泌的趋势，使炎症因子分泌水平接近对照组水平，同时能逆转GP减少巨噬细胞内TC、FC和CE的含量及脂质蓄积的作用；
　　6.检测发现GP呈时间依赖性增加THP-1巨噬细胞中KLF14的mRNA及蛋白的表达水平，且KLF14与miR-27a前体（pre-miR-27a）表达呈正性相关；
　　7.qRT-PCR结果显示，人源性KLF14过表达的慢病毒颗粒感染THP-1巨噬细胞后，与对照组（vector组）比较，pre-miR-27a的表达明显增加，而siRNA沉默KLF14，经GP处理的THP-1巨噬细胞中pre-miR-27a的表达则明显减少，GP上调miR-27a的趋势遭逆转；
　　8.转录抑制剂放线菌素D孵育经KLF14过表达的慢病毒载体感染的THP-1巨噬细胞后，KLF14的表达仍明显高于对照组，而放线菌素D能明显抑制pre-miR-27a的表达，遏制KLF14诱导上调pre-miR-27a的趋势；
　　9.采用JASPAR数据库查询发现人类KLF14与miR-27a启动子存在结合的可能性，并预测人类KLF14与miR-27a启动子存在结合位点；
　　10.ChIP实验显示KLF14能与miR-27a启动子-1521~-1508区序列结合；
　　11.构建突变型miR-27a启动子报告基因载体（MUT）与野生型miR-27a启动子报告基因载体（WT）后，并分别转染至HEK293T细胞中，荧光素酶报告基因检测结果显示，与野生组（WT）相比，突变组荧光素酶活性显著降低；
　　12.体视显微镜及油红O染色观察发现，与对照组相比，喂养GP能明显抑制小鼠主动脉As病变形成，而同时给予小鼠尾静脉注射miR-27a antagomir（ANa）或人源性LPL慢病毒载体（LV-hLPL）后小鼠病变明显加重；
　　13.HE染色结果显示，GP使小鼠主动脉窦病变面积明显减少；给药ANa后，则逆转GP的作用，病变面积增加；而给予LV-hLPL，实验小鼠动脉窦病变面积明显增加；
　　14.主动脉窦经油红O染色显示，与对照组比，GP组小鼠主动脉窦病变脂质红染区面积明显减少；如果给予ANa或LV-hLPL，主动脉窦脂质红染面积较GP组明显增加；
　　15.Masson染色显示主动脉窦斑块中的胶原纤维在GP组中主动脉窦胶原纤维含量明显减少；而在喂食GP同时给予ANa或LV-hLPL，主动脉窦病变区胶原纤维含量则明显增加；
　　16.与对照组相比，GP组小鼠血浆IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α炎症因子水平较对照组明显减少，而GP+ANa组和GP+LV-hLPL组小鼠血浆炎症因子较GP组则显著增加，与组无显著差异；
　　17.全自动生化分析仪检测显示，GP组与对照组相比小鼠血浆中HDL-C水平有所升高，TC及LDL-C水平均明显降低；GP+ANa组血浆TG、HDL-C水平较GP组明显降低，而TC及LDL-C水平则较GP组明显升高，而GP+LV-hLPL组血浆中TG、HDL-C水平较GP组也明显降低，TC及LDL-C水平则明显升高。
　　结论：
　　绞股蓝皂甙通过KLF14/miR-27a途径下调LPL的表达，抑制巨噬细胞炎症因子分泌及脂质蓄积，发挥抗As的作用。

目录

声明

主要缩略语中英文索引

第１章 绪 论

1.1 立题依据

1.2 科学假说

1.3 科学意义

第2章 MiR-27抑制巨噬细胞炎症因子分泌及脂质蓄积

2.1 前言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 讨论

2.6 小结

第3章 MiR-27减轻apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变程度

3.1 前言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

3.6 小 结

第4章 MiR-27抑制LPL减少巨噬细胞炎症因子分泌及脂质蓄积

4.1 前言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 讨论

4.6 小结

第5章 绞股蓝皂甙通过KLF14下调miR-27a抑制LPL表达减轻As病变

5.1 前言

5.2 实验材料

5.3 实验方法

5.4 实验结果

5.5 讨 论

5.6 小结

第6章 结 论

参考文献

综述：富含甘油三酯脂蛋白代谢相关基因与冠心病

攻读学位期间所获科研成果

致谢

课 题 资 助