Hedgehog信号通路在γ辐射致斑马鱼胚胎神经发育毒性中的作用及机制研究

摘要

目的
　　探讨 Hedgehog信号通路在γ辐射致斑马鱼胚胎神经发育毒性中的作用，进一步阐明γ辐射致神经发育毒性的作用机制，为γ辐射神经毒性的防治提供科学依据。
　　方法
　　以AB系斑马鱼为生物模型，用生物辐照仪对发育至5小时的斑马鱼胚胎进行不同辐照剂量的辐照，观察γ射线对斑马鱼胚胎的神经发育毒性作用：①显微镜下胚胎大体形态观察，并且分别测量24hpf和72hpf胚胎的卵黄囊直径和胚胎直径；②HE染色观察脑部组织细胞形态学变化；③RT-PCR技术检测γ辐射对斑马鱼胚胎 Hedgehog信号通路的相关基因mRNA表达变化；④Western blot检测γ射线对斑马鱼胚胎Hedgehog信号通路相关蛋白表达变化。
　　结果
　　1．以0Gy、0.25Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy的γ辐射分别对发育至5小时的斑马鱼胚胎进行辐照后，收集发育至6hpf、12hpf、24hpf、36hpf、48hpf及72hpf时的斑马鱼胚胎，在荧光显微镜下进行观察、拍照并测量。结果显示：0.5Gy辐照下的72hpf斑马鱼胚胎出现较为明显且典型的发育畸形，如卵黄囊肿大、心包水肿、脊柱弯曲等。0.25Gy辐照下的24hpf和72hpf胚胎直径长度相对于对照组有所增加，且此辐照剂量下的卵黄囊直径长度相对于对照组有所减少，与对照组相比差异均具有统计学意义（P＜0.05）。
　　2．以0Gy、0.25Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy的γ辐射分别对发育至5小时的斑马鱼胚胎进行辐照后，收集发育至12hpf、24hpf、36hpf、48hpf及72hpf时的斑马鱼胚胎，对各组斑马鱼胚胎进行石蜡切片HE染色后，于荧光显微镜下观察、拍照，切片可见未辐照组胚胎的脑部组织神经细胞排列整齐密集、结构完整清晰、细胞间隙无水肿且致密。辐照组的胚胎脑部神经元出现不同程度的发育异常，神经元细胞排列紊乱，细胞间间隙增大，细胞质浓缩，细胞出现不同程度的空洞。
　　3．以0Gy和0.5Gy的γ辐射分别对发育至5小时的斑马鱼胚胎进行辐照后，收集发育至6hpf、12hpf、24hpf、36hpf、48hpf和72hpf时的斑马鱼胚胎，通过RT-PCR技术检测斑马鱼胚胎shh、smo和gli2b的mRNA表达水平。结果显示，shh、smo和gli2b基因在斑马鱼胚胎每个发育时期均有不同程度的表达。经0.5Gy的γ射线辐照后，36hpf后期斑马鱼胚胎shh的mRNA表达量增加，smo的mRNA表达量减少，36hpf后期gli2b的mRNA表达量也降低，且与对照组相比差异均具有统计学意义（P＜0.05）。
　　4．以0Gy和0.5Gy的γ辐射分别对发育至5小时的斑马鱼胚胎进行辐照后，收集发育至6hpf、12hpf、24hpf、36hpf、48hpf和72hpf时的斑马鱼胚胎，通过Western blot检测斑马鱼胚胎shh、smo和gli2b的蛋白表达水平，与RT-PCR的检测结果存在一定差异，0.5Gyγ辐射后的12hpf后期斑马鱼胚胎shh蛋白表达量下调，smo蛋白在斑马鱼胚胎整个发育时期蛋白水平变化是呈现先上调后下调的趋势，经0.5Gyγ射线辐照后，只有24hpf胚胎的gli2b蛋白表现为上调，其余组的gli2b蛋白均表现为下调，且辐照组与对照组相比，蛋白表达差异均具有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论
　　1.较低剂量（0.25Gy～2Gy）的γ射线能引起斑马鱼胚胎的神经发育毒性，可能通过Hedgehog信号通路调控斑马鱼胚胎的神经发育。
　　2.发育早期（5hpf）的斑马鱼胚胎可作为低剂量辐射0.5Gy生物预警的敏感模式生物，shh、smo和gli2b基因及其表达蛋白可作为敏感生物标志物。

目录

声明

主要英文缩略语索引

第1章 前 言

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第3章 实验结果

3.1γ辐射对斑马鱼胚胎形态学的影响

3.2 HE染色观察脑部神经元结构

3.3 不同时期斑马鱼胚胎的shh、smo、gli2b基因在0Gy、0.5Gy辐照下的mRNA表达水平

3.4 不同时期斑马鱼胚胎的shh、smo、gli2b基因在0Gy、0.5Gy辐照下的蛋白表达水平

第4章 讨论

4.1γ辐射对斑马鱼胚胎形态学的影响

4.2 HE染色观察斑马鱼胚胎脑部组织细胞形态学变化

4.3 不同时期斑马鱼胚胎的shh、smo、gli2b基因在0Gy、0.5Gy辐照下的mRNA表达水平

4.4 不同时期斑马鱼胚胎的shh、smo、gli2b基因在0Gy、0.5Gy辐照下的蛋白表达水平

第5章 结论

参考文献

文献综述:Hedgehog信号通路在胚胎发育过程中的调控作用

附录

在读期间发表的科研论文和参与的科研项目

致谢