结核分枝杆菌十二种蛋白抗原中人T/B细胞抗原表位多态性研究

摘要

结核病(tuberculosis，TB)是世界范围内最严重的传染病之一。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)统计报告，2016年，全球范围内有1040万新发病例，167万人因结核病而死亡，严重影响人类健康和社会经济的发展。随着人口流动的加速、人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)的并发感染、耐多药结核病(Multi-Drug Resistance Tuberculosis,MDR-TB)的发生和流行，使得现阶段结核病流行的控制仍面临着严峻的考验。 卡介苗是目前唯一一个在全球范围内用于结核病预防接种的疫苗。一直以来，其免疫保护效力都备受争议。为了实现结核病的控制目标，发展新的高效的抗结核病疫苗已迫在眉睫。有关文献报导重组BCG具有安全，高效，应用广泛，免疫持久，成本低价，热稳定性强，易于操作等优点，具有很大的研发潜能。其技术关键在于研究发现特异高效的卡介苗中缺乏或低表达的抗原。因此，本研究中，我们对结核分枝杆菌6个RD区的12个蛋白抗原（Rv0222，Rv0309，Rv1255c，Rv1256c，Rv1977，Rv1979c，Rv1984c，Rv1985c，Rv1987，Rv3871，Rv3878和Rv3879c）的基因及其人T/B细胞抗原表位多态性进行研究，为后续开发有效的新型的抗结核疫苗提供基础。 本实验选取了180株来自我国不同省（自治区或直辖市）的结核分枝杆菌临床分离的不同Spoligotyping基因型的菌株和11株来自不同国家和地区的卡介苗菌株，采用PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增和测序，对结核分枝杆菌基因组中RD区的12个蛋白抗原编码基因进行了检测，并以NCBI(National Center of Biotechnology Information)网站下载获得的结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)菌株的全基因组数据作为参照序列，对所检测的12个RD区蛋白抗原基因的序列多态性进行了比对分析。通过IEDB（Immune Epitope Database）数据库检索获得了这12个蛋白抗原中的人T/B细胞抗原表位序列，对其中的细胞抗原表位区的变异情况进行分析；借助Mega软件，计算出整个基因编码区，T/B细胞和非T/B细胞抗原表位序列区的dN值，dS值以及dN/dS，对这12个蛋白抗原基因在结核分枝杆菌基因中的保守与否，以及对不同序列区受到宿主免疫系统的选择压力进行评价。 结果显示，这些蛋白的编码基因在临床菌株中具有高度的保守性，但也存在部分菌株的基因突变。在检测的180株结核分枝杆菌临床分离株中，4株（2.22%）存在Rv0309基因特异性的SNP（G168T,Gln159His）突变；2株（1.11%）存在Rv1977基因的G203缺失；4株（2.22%）存在Rv1979c基因的1个同义SNP（C1443T，Arg481Arg）位点；2株（1.11%）存在Rv1984c基因的1个C592T/CAG198TAG变异位点，然而TAG为终止密码子，所以此变异为终止突变；92株（51.11%）存在Rv1985c基因的1个同义SNP（G102C,Pro34Pro）突变；105株（58.33%）存在Rv3879c基因的1个非同义SNP（G130A,Asp44Asn）突变位点。此外，部分菌株中还存在一些基因的单独异义突变位点，以及单个碱基的插入或缺失，这些突变同样也会影响到其对应密码子编码的氨基酸。同时，使用Mega软件计算后，发现：Rv0309，Rv1256c，Rv1977，Rv1984c和Rv1987基因的整个编码区、T/B细胞和非T/B细胞抗原表位区的dN/dS值均＞1。Rv1987基因的T细胞抗原表位区dN/dS值低于非T细胞表位区，Rv0309，Rv1256c，Rv1977和Rv1984c基因的T/B细胞抗原表位区dN/dS值均高于非T/B细胞表位区。Rv1979c、Rv1985c、Rv3871、Rv3878和Rv3879c基因的整个编码区，T/B细胞表位区的dN/dS值均＜1，而非T/B细胞表位区的dN/dS值均＞1. 本研究的结核分枝杆菌基因组中6个RD区的12个蛋白编码基因中，Rv0222和Rv1255c基因中未发现序列多态性，其余都存在不同程度的变异。根据dN、dS和dN/dS值判断，Rv1979c、Rv1984c、Rv1985c、Rv3871、Rv3878和Rv3879c基因保守性较好，经进一步研究有可能成为开发新型抗结核疫苗的候选抗原。而Rv0309、Rv1256c、Rv1977和Rv1987基因发生了明显的变异，认为这些基因在与宿主免疫系统协同进化的过程中可能存在正向选择作用，存在一定的免疫逃逸。

目录

声明

缩略词（Abbreviation）

第1章 绪 论

第2章 材料和方法

2.1 菌株材料

2.2 主要试剂

2.3 仪器设备

2.4 菌株

2.5 改良罗氏培养基制备

2.5.1 改良罗氏培养基基础成分

2.5.2 改良罗氏培养基配置

2.6 菌株的核酸提取

2.7 相关基因序列扩增

2.7.1 PCR引物设计

2.7.2 PCR反应体系

2.7.3 PCR反应条件

2.7.4 PCR产物检测及测序

2.7.5 目的基因中T/B细胞表位区的确定

2.7.6 数据分析

第3章 结果

3.1 临床分离菌株信息

3.2 PCR结果

3.3 12个蛋白基因中T/B细胞表位信息

3.3.1 Rv0222基因

3.3.2 Rv0309基因

3.3.3 Rv1255c基因

3.3.4 Rv1256c基因

3.3.5 Rv1977基因

3.3.6 Rv1979c基因

3.3.7 Rv1984c基因

3.3.8 Rv1985c基因

3.3.9 Rv1987基因

3.3.10 Rv3871基因

3.3.11 Rv3878基因

3.3.12 Rv3879c基因

3.4 12个RD区蛋白抗原基因中的序列变异情况

3.4.1 Rv0309基因

3.4.2 Rv1256c基因

3.4.3 Rv1977基因

3.4.4 Rv1979c基因

3.4.5 Rv1984c基因

3.4.6 Rv1985c基因

3.4.7 Rv1987基因

3.4.8 Rv3871基因

3.4.9 Rv3878基因

3.4.10 Rv3879c基因

3.5 12个蛋白抗原编码基因中T/B细胞表位区的多态性

3.5.1 Rv0309基因

3.5.2 Rv1256c基因

3.5.3 Rv1977基因

3.5.4 Rv1979c基因

3.5.5 Rv1984c基因

3.5.6 Rv1985c基因

3.5.7 Rv1987基因

3.5.8 Rv3871基因

3.5.9 Rv3878基因

3.3.10 Rv3879c基因

第4章 讨 论

第5章 结 论

参考文献

综述:结核分枝杆菌RD区蛋白研究进展

附录

作者攻读学位期间的科研成果

致谢