结核分枝杆菌人新B细胞表位及10种特异蛋白的抗原性研究

摘要

在结核病（TB）的免疫学研究中，特异抗原及其抗原表位的研究对结核病的诊断技术和疫苗发展具有极为重要的作用。抗原表位是决定抗原特异性和免疫效能的特殊基团或空间结构。B细胞表位在感染免疫中发挥了重要作用，如激活体液免疫应答和调节细胞免疫应答。因此，研究抗原 B细胞表位，有助于结核病快速诊断试剂和疫苗的研究。本研究一是开展结核分枝杆菌(MTB)新抗原的B细胞表位预测和筛选，二是选取抗原表位数较多的特异性抗原进行克隆表达纯化，并对纯化的重组蛋白及 B表位多肽进行血清学评价，为研发结核病特异诊断试剂和新疫苗提供基础。
　　根据基因组学、蛋白质组学、免疫组学和生物信息学原理，排除PE/PPE蛋白、转座子基因以及已知B表位的蛋白抗原，从结核分枝杆菌全基因组的蛋白质基因序列中筛选新的蛋白抗原。利用生物信息学和SEPPA2.0软件，预测新抗原的B细胞表位，分析、优选并合成B细胞表位多肽。
　　阅读文献、根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)和免疫表位数据库（IEDB），分析并选择有抗原表位的结核分枝杆菌特异性抗原。蛋白抗原的编码基因以标准株H37Rv的DNA为模板，PCR扩增并提取目的基因，以原核表达载体PET32a构建重组质粒，双酶切鉴定和测序100％正确的重组子进行诱导表达，SDS-PAGE分析鉴定。大量诱导后镍离子亲和层析柱层析纯化，纯化效果不理想的蛋白再次使用纯化试剂盒进行纯化。纯化后的包涵体进行复性，使用BCA法对蛋白的浓度进行测定。
　　将合成的B细胞表位多肽及纯化后的蛋白包被酶标板，棋盘滴定法确定抗原及多肽、一抗和二抗的最佳稀释度，以结核病人血清及健康志愿者的血清为一抗，间接酶联免疫吸附试验（ELISA）对B细胞表位多肽及重组蛋白抗原进行评价。
　　本研究经过软件的预测及筛选，成功预测并合成了结核分枝杆菌3个新蛋白的共13条B细胞线性表位多肽，包括蛋白SodC成功合成3条， Mog为4条和Rv1566c为6条，每条多肽的纯度大于90%，满足实验要求。Mog抗原成功预测了构象表位，构象表位需要通过重组蛋白的克隆表达，再进行血清学验证。
　　本研究通过文献检索及生物信息学筛选，确定了9个已知特异性蛋白抗原，并完成了此九种蛋白及构象表位抗原Mog的克隆表达纯化，酶切鉴定结果正确，测序结果与NCBI中的序列完全一致。10种蛋白的诱导表达纯化，最终得到了纯化效果较理想的重组蛋白。
　　间接ELISA法对B表位多肽及10种蛋白抗原进行评价，棋盘滴定确定多肽的包被浓度为3.13μg/ml，蛋白抗原PfkB、Rv2628、Rv2653c、Mpt83、Mpt70、Lppx、EsxR、FadD28、DevS和Mog的最佳包被浓度分别为0.46μg/ml、1.03μg/ml、1.31μg/ml、1.53μg/ml、1.20μg/ml、1.15μg/ml、5.53μg/ml、0.85μg/ml、1.08μg/ml和1.65μg/ml。血清的最佳稀释度PfkB为1:50，EsxR为1:400，Rv2628、Rv2653c、Mpt83、Mpt70、Lppx、FadD28、DevS、Mog及多肽的血清最佳稀释度均为1:100。
　　该实验选取了104份阳性血清和104份阴性血清，ELISA法分别对10种蛋白抗原及13条多肽进行血清学评价。使用SPSS17.0软件分析实验数据，PfkB、Rv2628、Rv2653c、Mpt83、Mpt70、Lppx、EsxR、FadD28、DevS和Mog的灵敏度分别为73.08%、54.81%、58.65%、94.23%、79.81%、77.88%、92.31%、86.54%、91.35%、89.42%，特异度分别为90.57%、94.34%、87.74%、59.43%、86.79%、77.36%、62.26%、82.08%、83.96%、69.81%，ROC曲线下面积分别为0.882、0.789、0.773、0.825、0.884、0.851、0.822、0.891、0.870和0.901。除Rv2628、Rv2653c的Youden指数小于0.5外，其它蛋白的Youden指数均大于0.5，Mog的Youden指数最大为0.734。SodC的3条B细胞表位多肽，灵敏度分别为88.46%、65.38%、72.12%，特异度为75.96%、91.35%和89.42%，ROC曲线下面积均大于0.85。Mog蛋白的4条B细胞表位多肽中P209的灵敏度、特异度最高，分别为88.46%、88.69%，ROC曲线下面积为0.934。Rv1566c的6条B细胞表位多肽，灵敏度范围为77.88%~92.31%，特异度介于69.23%~85.58%，ROC曲线下面积均大于0.849。
　　本研究成功地筛选出3个结核分枝杆菌新抗原，完成了3个新抗原的13条B细胞线性表位的预测、筛选及多肽的合成，新抗原Mog成功预测构象表位。构象表位Mog及9种已知的特异蛋白抗原完成了克隆、表达和纯化。用血清学抗体检测方法评价了结核分枝杆菌B细胞表位多肽及重组蛋白的抗原性。研究结果将为研制结核病特异诊断试剂和新疫苗提供依据。

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第1章 绪 论

第2章 新抗原人B细胞表位的预测合成及10种蛋白抗原的克隆表达纯化

2.1 实验材料

2.1.1 菌株及载体的来源

2.1.2 主要试剂及材料

2.1.3 主要试剂配制

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 主要生物信息学分析软件

2.2 实验方法

2.2.1 结核分枝杆菌新抗原的筛选、B细胞表位的预测、优选和合成

2.2.2 重组蛋白的克隆表达

2.2.3 重组蛋白大量的诱导表达、鉴定与纯化

2.2.4 纯化包涵体的透析复性

2.2.5 重组蛋白浓度的测定

2.3 实验结果

2.3.1 新蛋白B细胞表位的预测、筛选及多肽的合成

2.3.2 特异蛋白抗原的编码基因中人T/B细胞表位的分布情况

2.3.3 目的基因的PCR扩增

2.3.4 重组质粒的构建

2.3.5 PCR阳性菌落的鉴定

2.3.6 重组质粒的双酶切鉴定结果

2.3.7 重组质粒目的基因的测序结果

2.3.8 重组质粒的小量诱导表达

2.3.9 大量诱导后表达形式的验证

2.3.10 10种重组蛋白的纯化

2.3.11 BCA法蛋白浓度的测定结果

2.4 讨 论

第3章 蛋白抗原及多肽的血清学评价

3.1 实验材料

3.1.1 血清标本来源：

3.1.2 试剂及材料

3.1.3 主要试剂的配制

3.1.4 主要仪器

3.1.5 分析软件

3.2 血清学验证方法

3.2.1 棋盘滴定确定目的蛋白、多肽及血清的最佳稀释度

3.2.2 确定最佳二抗稀释度

3.2.3 待测血清标本的检测

3.2.4 数据分析

3.3 实验结果

3.3.1 蛋白抗原及多肽最佳包被浓度及血清稀释度

3.3.2 二抗的最佳稀释度

3.3.3 抗原及多肽检测待测血清的ELISA结果

3.4 讨论

第4章 结论

参考文献

文献综述 :B细胞抗原表位的研究及在结核分枝杆菌血清学诊断中的应用

作者攻读学位期间的学术成果

致谢