DADS下调calreticulin促进C/EBPα表达诱导人白血病HL-60细胞分化

摘要

白血病严重危害人类健康，诱导分化治疗白血病具有重要的现实意义。二烯丙基二硫（diallyl dissulfide，DADS）是大蒜的一种脂溶性有效成分，是一种很有开发潜力的抗肿瘤药物。我们前期工作结果显示，小剂量DADS能体内外诱导HL-60细胞分化并能增加细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生。我们采用蛋白质组学技术筛选出18个DADS诱导HL-60细胞分化的差异蛋白，其中内质网Ca2+结合伴侣蛋白—钙网织蛋白（calreticulin，CRT）表达明显下调。文献研究显示，CRT对肿瘤细胞的分化具有重要的调控作用，C/EBPα是粒细胞分化的重要调节者，siRNA干扰技术抑制CRT表达可促进C/EBPα的表达。 目的： 在前期工作的基础上，研究DADS下调calreticulin促进C/EBPα表达诱导人白血病HL-60细胞分化的作用机制。 方法： 收集临床外周血标本，流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测CRT和C/EBPα在外周血白细胞中的表达情况，并研究两者的相关性；HE染色观察DADS诱导HL-60细胞分化前后的形态学改变；RT-PCR和western blot检测DADS作用HL-60细胞前后CRT和C/EBPα的表达；构建SCID小鼠成瘤模型，检测DADS对SCID小鼠成瘤等生物学行为以及对CRT和C/EBPα表达的影响；FCM检测DADS处理HL-60细胞前后细胞内ROS水平，western blot检测AKT，p-AKT，PERK，p-PERK，CRT，C/EBPα等的表达；RNA免疫共沉淀技术（RIP）研究CRT与C/EBPαmRNA的结合情况。 结果： 1.CRT和C/EBPα在白血病患者外周血白细胞中的表达及两者的相关性 FCM结果显示，白血病人白细胞中CRT的表达高于对照组（p＜0.05），白血病人中C/EBPα的表达低于正常人（p＜0.05）。各组中CRT和C/EBPα两者的表达具有相关性。 2.CRT和C/EBPα在DADS诱导分化的HL-60细胞中差异表达 HE染色结果显示，与对照组相比，DADS作用HL-60细胞48h后，细胞出现明显的分化现象。 DADS分别作用HL-60细胞0h、12h、24h、48h后，RT-PCR和western blot实验数据表明，随着DADS处理时间延长，CRT在mRNA水平和蛋白水平的表达呈逐渐降低的特性（p＜0.05），C/EBPα在mRNA水平和蛋白水平的表达呈逐渐升高的特性（p＜0.05）。 3.DADS对SCID小鼠成瘤等生物学行为以及对CRT和C/EBPα表达的影响 HE染色SCID肿瘤切片，染色结果显示，经过药物处理的组织细胞出现明显的分化现象。 肿瘤生长曲线显示，实验组瘤体生长速度较对照组明显减慢。与对照组相比，药物明显抑制了肿瘤的体积。21mg/kg DADS(LD DADS)，42mg/kgDADS(HD DADS)和11mg/kgATRA组中的肿瘤抑瘤率分别为50.34％，76.34％和80.35％。 Western blot实验结果表明，与对照组相比，药物处理组中CRT的表达明显降低（p＜0.05），C/EBPα的表达明显升高（p＜0.05）。 4.DADS通过ROS信号通路诱导CRT下调和易位 细胞免疫荧光实验结果显示，DADS作用与HL-60细胞48h后，CRT的从胞内转位至细胞膜。 FCM结果显示，DADS作用于HL-60细胞0h、12h、24h、48h、72h后，细胞中ROS的含量显著升高（p＜0.05）。 Western blot结果显示，与对照组相比，DADS处理细胞组和NAC+DADS处理细胞组中CRT表达显著降低，C/EBPα的表达显著升高（p＜0.05）。与对照组相比，DADS处理细胞中，胞内PERK,p-PERK,AKT,p-AKT,CRT,C/EBPα等蛋白的表达产生变化（p＜0.05）。 5.DADS下调CRT促进C/EBPαmRNA的表达诱导HL-60细胞分化 Western blot结果显示，DADS作用HL-60细胞48h后，与对照组相比，处理组细胞中CRT含量明显降低（p＜0.05）。 RNA免疫共沉淀实验结果显示，CRT高表达导致C/EBPαmRNA表达下调。 结论： 1.与对照组相比，CRT在临床白血病人外周血样本中表达上调，C/EBPα在临床白血病人中表达下调，且两者表达之间具有相关性。 2.DADS可在体内外下调CRT表达，上调C/EBPα表达，诱导HL-60细胞分化。 3.DADS可增加HL-60细胞中ROS的产生，并通过ROS信号通路诱导人白血病HL-60细胞分化。 4.DADS下调CRT促进C/EBPαmRNA的表达诱导HL-60细胞分化。

目录

声明

缩略词

第1章 绪 论

第2章 材料与方法

2.1.1细胞

2.1.2小鼠

2.1.3试剂

2.1.4主要仪器

2.2. 实验方法

2.2.1 患者样品和临床数据

2.2.2 DADS诱导HL-60细胞分化模型的建立及检测

2.2.3 重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠成瘤

2.2.4 逆转录定量聚合酶链式反应 (RT-qPCR)

2.2.5 ROS水平的测量

2.2.6 RNA免疫沉淀(RIP)

2.2.7 免疫荧光

2.2.8Western blot实验方法

2.2.9 数据分析

第3章 结果

3.1 CRT和C/EBPα在白血病患者外周血白细胞中的表达及相关性研究

3.1.1骨髓的瑞氏染色检验

3.1.2 FCM检测临床样本白细胞内CRT和C/EBPα的表达

3.2 CRT和C/EBPα在DADS诱导分化的HL-60细胞中的差异表达

3.2.1 瑞氏染色检测DADS诱导HL-60细胞分化

3.2.2RT-PCR检测HL-60细胞内CRT和C/EBPα mRNA的表达

3.2.3Western blot检测HL-60细胞内CRT和C/EBPα的表达

3.3 DADS抑制SCID小鼠的肿瘤生长，调节CRT和C/EBPα的表达

3.3.1 DADS抑制SCID小鼠的肿瘤生长

3.3.2 HE染色检测肿瘤切片

3.3.3 Western blot检测肿瘤组织中蛋白CRT和C/EBPα的表达

3.4.1 免疫荧光检测细胞内CRT蛋白的定位

3.4.2 FCM检测ROS水平

3.4.3Western blot检测DADS处理组和NAC+DADS处理组中CRT和C/EBPα的表达

3.4.4Western blot检测ROS-PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达

3.5DADS下调CRT促进C/EBPα mRNA的翻译诱导的HL-60细胞分化

3.5.1 Western blot检测细胞内CRT表达变化

3.5.2 RNA免疫共沉淀

3.5.3 DNA凝胶电泳检测C/EBPαmRNA的含量

第4章讨论

结论

参考文献

攻读硕士学位期间研究成果

文献综述:Calreticulin: a potential anti-cancer therapeutic target

致谢