硫化氢改善β2微球蛋白诱导大鼠的认知功能障碍：涉及海马自噬流的恢复

摘要

目的： β2微球蛋白(β2-microglobulin,B2M)作为一种促衰老因子，其过度堆积可导致认知功能障碍。硫化氢(Hydrogen sulfide,H2S)是一种具有神经保护作用的气体信号分子，能够调节学习记忆功能。自噬是细胞内的一种重要的自我保护机制，对认知功能具有重要的调节作用。本课题将探讨H2S是否能够改善B2M诱导的认知功能损害的作用，其机制是否涉及调节海马自噬水平。 方法： 1.雄性SD大鼠侧脑室注射B2M(0.3μg,i.c.v.,single dose)建立认知功能障碍模型。 2.Y迷宫实验、新物体识别实验和Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆功能。 3.透射电镜观察海马组织自噬小体及自噬溶酶体的数量。 4.Western Blot检测海马组织p62蛋白的表达。 结果： 1.H2S改善B2M诱导大鼠的认知功能障碍 SD大鼠给予NaHS(30和100μmol/kg/d,i.p.)预处理7d后，在第8天同时给予B2M(0.3μg,i.c.v.,single dose)及NaHS共处理，接着继续予以NaHS处理6天后进行Y迷宫、新物体识别、Morris水迷宫实验来检测大鼠的认知功能。在Y迷宫实验中，B2M大鼠的Y迷宫交替正确率明显下降，而NaHS可提高B2M大鼠的交替正确率。在新物体识别实验中，B2M大鼠的新物体识别指数显著降低，而NaHS可提高B2M大鼠的新物体识别指数。在Morris水迷宫实验中，B2M大鼠在获得性训练期第4-5天寻找平台的潜伏期明显延长、在探索期穿过原平台象限次数及目标象限时间百分比明显降低，而NaHS可明显缩短B2M大鼠在Morris水迷宫获得性训练期第4-5天寻找平台的潜伏期、增加其在探索期穿过原平台象限次数及目标象限时间百分比。以上结果表明，H2S能够改善B2M处理大鼠的认知功能。 2.H2S可逆转B2M对大鼠海马自噬流的阻断作用 为了观察H2S能否影响B2M大鼠海马自噬流的变化，我们采用透射电镜检测大鼠海马自噬小体及自噬溶酶体的数量及免疫印迹法(Western blot,WB)检测大鼠海马p62蛋白的表达水平。结果显示：与对照组相比，B2M处理后，大鼠海马组织自噬小体与自噬溶酶体数量的比值及p62蛋白表达明显增加，表明B2M可阻断大鼠海马自噬流。而予以NaHS处理后，B2M大鼠海马组织内的自噬小体与自噬溶酶体数量的比值及p62蛋白表达明显减少，表明H2S可恢复B2M大鼠海马自噬流。 结论： H2S可改善B2M诱导大鼠的认知功能障碍，其机制涉及海马自噬流的恢复。

目录

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英文缩略语索引

第一章 绪论

1.1 β2微球蛋白(β2-microglobulin, B2M)与认知功能障碍

1.2硫化氢(Hydrogen sulfide, H2S)拮抗认知功能障碍

1.3 自噬 (Autophagy) 对认知功能障碍的调节作用

1.4 本课题的研究问题和研究思路

第二章 材料与方法

2.1. 试剂和仪器

2.1.1 主要试剂和药品

2.1.2. 主要仪器和设备

2.2. 实验动物

2.3. 药品与试剂的配制

2.3.1. PBS缓冲液的配制

2.3.2. NaHS母液的配制

2.3.3. B2M溶液的配制

2.3.4.戊巴比妥钠溶液的配制

2.3.5. 1×Tris-buffer电泳缓冲液的配制

2.3.6.过硫酸胺 (AP, 10 %)的配制

2.3.7. 转移base的配制

2.3.8. TBST的配制

2.3.9. 5%脱脂牛奶的配制

2.4.1. 实验流程

2.4.2. SD大鼠侧脑室埋管手术

2.4.3. 通过侧脑室上的管道进行药物微量注射

2.4.4. Y迷宫实验

2.4.5. 新物体识别实验

2.4.6. Morris水迷宫(Morris water maze)实验

2.4.7. 透射电镜检测海马自噬

2.4.8. 大脑内海马组织匀浆的制备

2.4.9.Western blot检测海马细胞内p62蛋白的表达

2.4.10. 统计分析

第三章 结 果

3.1.1. H2S可提高B2M大鼠的Y迷宫交替正确率

3.1.2. H2S可提高B2M大鼠的新物体识别指数

3.1.3. H2S可改善B2M大鼠在水迷宫实验中的学习记忆能力

3.2. H2S逆转B2M对大鼠海马自噬流的阻断作用

第四章 讨论

4.1 H2S可改善B2M大鼠的认知功能

4.2 海马自噬流参与H2S改善B2M诱导的认知功能障碍

第五章 结论

参考文献

文献综述:脑脊液中β2微球蛋白在神经退行性疾病中的研究进展

攻读硕士期间发表的论文

致谢