基因分型技术在梅花鹿结核病研究中的应用

摘要

结核病是一种人畜共患病，我国重要的经济动物--梅花鹿就是它的宿主之一。梅花鹿结核病病原菌包括牛型分枝杆菌、人型结核分枝杆菌等等，而这两种分枝杆菌同为人类结核病的主要病原菌，因此病鹿尤其是开放性结核病鹿可能成为人类结核病主要的传染源之一，应当引起人们的高度重视。本文主要应用分枝杆菌散在重复单位(MIRU)和间隔区寡核苷酸(Spoligotyping)两种分型方法对中国东北部梅花鹿结核病进行分子流行病学研究，比较两种方法应用效果的差异，调查我国东北部地区梅花鹿结核病流行状况，探讨其病原菌的基因型特点。 首先进行了结核杆菌分离培养和鉴定工作，包括病料的前处理方法的比较、培养基培养效果的对比，以及结核杆菌的形态学鉴定和PCR鉴定。结果发现，酸处理法较碱处理法阳性率高；分离培养采用7H9培养基会获得较好的效果，在传代培养中改良罗氏培养基和丙酮酸钠培养基效果较好；最后，经形态鉴定和PCR鉴定后，从中国东北部(吉林、辽宁、黑龙江)三省共分离得到了120株梅花鹿源结核分枝杆菌临床分离株，其中人型为92株，牛型为28株。 其次，分枝杆菌散在重复单位(MIRU)分型技术在梅花鹿结核病分子流行病学研究中的应用。提取上述120株分枝杆菌基因组DNA，采用PCR方法扩增结核杆菌基因组中的12个MIRU位点，计算每个菌株不同串联重复位点的拷贝数，利用Hunter-Gaston指数(HGDI)评价MIRU法的分辨能力。结果发现，MIRU法将120株菌株分为120个基因型(HGDI=1)，分辨率达到了100％，高于MIRU分型法对人源结核杆菌的分辨率。而MIRU位点多样性(h)分析结果显示：除位点27多态性最低h=0.0697，几乎没有分辨价值外，位点4、16、24、26、39、40显示了高度的多态性(h≥0.6)，位点2、10、20、23、31显示了中度多态性(0.6>h≥0.3)，多态性均较高，说明MIRU分型方法分辨力强，且各地病原菌相关性较低，几乎没有成簇现象。 间隔区寡核苷酸分型技术(Spoligotyping)在梅花鹿结核病分子流行病学研究中的应用。扩增结核杆菌基因组中的直接重复区(DR区)，利用各自特异的寡核苷酸探针与标记后的扩增产物进行杂交确定其基因型。实验结果表明Spoligotyping分型法将菌株分为34个基因型，其中29种基因型含有1个菌株，5种基因型含有4个或4个以上菌株(H=0.7131)，其分辨率略微低于MIRU分型。 比较上述两种基因分型方法可见，MIRU分型法显示了更好的分辨率，同时，结合MIRU位点中6个具有高度多态性的重复区就能够对梅花鹿结核病的病原菌进行较好的分辨，将会进一步缩短实验所需时间，使MIRU分型更加快速，简洁。而Spoligotyping分型需要设计合成43对探针，相对于MIRU分型法实验费用较高，对于大规模的结核杆菌检测不够经济。因此，在鹿结核病的分子流行病学研究中应把MIRU分型法作为首选分型法，以Spoligotyping法作为补充。 中国东北部地区梅花鹿结核杆菌的基因型多态性较高，不同基因型菌株没有出现成簇的情况，证明我国东北部梅花鹿的结核病预防和控制较好，没有出现大规模的爆发流行，只有各地散在发生，并且各地区交叉感染较轻微。

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声明

第一章绪论

1.1研究的目的与意义

1.2结核分枝杆菌生物学特性及分子流行病学的研究进展

1.2.1结核分枝杆菌的生物学特性

1.2.3结核分支杆菌基因组

1.2.4结核病流行的趋势

1.2.5结核分枝杆菌流行病学研究进展

1.2.6限制性片段长度多态性

1.2.7混合接头PCR

1.2.8间隔区寡聚核苷酸分型(spoligotyping)

1.2.9随机扩增多态性DNA(RAPD)

1.2.10数目可变的串联重复序列和结核分枝杆菌散在分布重复单位(VNTR-MIRU))分型

1.2.11 DNA芯片技术

1.2.12牛型结核分枝杆菌研究进展

1.2.13牛型结核分枝杆菌流行病学

1.2.14牛型结核分枝杆菌基因特征

1.2.15牛型结核分枝杆菌分子流行病学

第二章中国东北部梅花鹿结核病分子流行病学研究

2.1材料

2.1.1病料来源

2.1.2主要仪器与试剂

2.1.3主要试剂配制

2.2方法

2.2.1细菌分离培养

2.2.2菌株的PCR鉴定

2.2.3分支杆菌散在重复单位(MIRU)技术的建立

2.2.4间隔区寡核甘酸分型技术(Spoligotyping)的建立

2.3结果

2.3.1病原菌的分离培养

2.3.2病原菌PCR鉴定

2.3.3 MIRU分型

2.3.4 Spoligotyping分型

2.3.5 Spoligotyping分型与MIRU分型效果比较

2.4讨论

2.4.1不同前处理方式对分离培养结果的影响

2.4.2不同培养基的分离效果比较

2.4.3 PCR鉴定

2.4.4两种基因分型法的比较

2.4.5两种基因分型法的分辨率比较

2.4.6基因分型技术在梅花鹿结核病研究中的应用

结论

参考文献

致谢

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