重组免疫毒素ScFv-PE40在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定

摘要

猪囊尾蚴病是危害最为严重的人畜共患寄生虫病之一，该病不仅造成巨大的经济损失，而且对人类存在着重要的健康隐患。人不仅是中间宿主，而且是唯一的终末宿主。囊尾蚴常在脑、眼、心脏等重要器官寄生，其中以寄生于神经系统的脑囊虫病引起的临床症状最为严重，极大危害了人类健康。多年来防治本病主要是以药物防治为主，但是由于抗药性的不断出现以及药物残留等问题的严重性，使得利用免疫预防技术来取代药物成为控制猪囊尾蚴病的必然，且在寄生虫学界已达成了共识。课题组已经获得抗猪囊尾蚴头节抗原的单克隆抗体，并从抗体中已提取单链抗体ScFv，且与绿脓杆菌外毒素PE40链接并克隆到质粒载体pET28a中。 目的： 通过重组免疫毒素基因ScFv-PE40在大肠杆菌BL21中表达及纯化，以获得具有一定纯度的重组免疫毒素，从而进行体外六钩蚴杀伤实验，验证重组免疫毒素的杀伤效果，为进一步动物实验和重组毒素的应用奠定基础，也为囊尾蚴病的预防和治疗提供理论依据。 方法： 首先通过CaCl2法制作感受态大肠杆菌BL21，将含有抗囊尾蚴头节的单链抗体基因(ScFv)和绿脓杆菌外毒素基因(PE40)的重组质粒载体pET-28a转化到大肠杆菌BL21中，培养后，将菌液铺于含有卡那霉素的LB固体培养基上37℃过夜，次日观察菌落，并挑取12个菌落分别培养后，提取质粒，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，进而进行特异性的IPTG诱导表达，表达产物通过SDS-PAGE和Wlestern-Blotting分析鉴定，以检测蛋白的反应原性。将目的蛋白通过金属Ni2+亲和层析柱纯化，纯化后，通过体外六钩蚴杀伤实验检测目的蛋白的杀伤作用，同时绘制杀伤曲线，为进一步的活体动物实验奠定基础，同时也为囊尾蚴疾病的预防和治疗提供理论依据。 结果： 将含有pET28-ScFv-PE40的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中后，提取质粒，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，在约5400bp处和约1800bp处各有一条核酸条带，核酸长度与事先序列测定长度相同，说明菌中所含质粒为目的质粒。将E.coil BL21(DE3)通过IPTG诱导表达，经SDS-PAGE分析，ScFv-PE40基因获得了表达，各小时的表达量几乎无差别，表达蛋白的相对分子量约为68kDa(3.5 kDa的pET-28a肽段和68 kDa ScFv-PE40)，表达量约占菌体总蛋白的13.8％。而含空质粒pET-28a的对照组则未见大小一致的蛋白质表达。为了进一步鉴定表达产物，将表达的蛋白质电转移至PVDF转移膜上，进行蛋白质印迹分析，可见68 kDa处有一条明显的蛋白印迹带，说明目的蛋白具有一定的反应原性。 通过金属Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白后，在约68×103处有一条蛋白富集带，位置与融合蛋pET28-ScFv-PE40的表达蛋白相一致。SDS-PAGE分析表明，纯化后目的蛋白的纯度在95％以上，可溶性蛋白的回收率约为50％，回收量为5mg/L。将纯化的目的蛋白进行体外六钩蚴杀伤实验，并绘制杀伤曲线。 由细胞杀伤曲线可得，随着时间的推移，处理组和对照组形态完整六钩蚴的数目均呈逐渐减少趋势，但加入重组毒素组形态完整六钩蚴数目的下降明显快于对照组(P<0.05)，并且比较三个杀伤曲线，可见随着重组免疫毒素剂量的减少，处理组下降逐渐减慢，表明重组毒素对六钩蚴具有较强的杀灭作用，但是重组毒素对六钩蚴的作用有一定的剂量依赖性。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1猪囊尾蚴病的流行、分布及危害

1.1流行因素

1.2猪囊尾蚴病的分布

1.3猪囊尾蚴病的危害

2本研究的目的和意义

第一篇 文献综述

第一章 重组免疫毒素的组成及作用机制

1传统的免疫毒素

2基因重组免疫毒素

第二章 猪囊尾蚴病病原入侵与免疫机制研究进展

1病原入侵致病作用及免疫逃避机制

2囊尾蚴免疫抑制及免疫逃避机制的研究进展

3研究猪囊尾蚴逃避机制的意义和今后的方向

第二篇 研究内容

实验一 重组免疫毒素ScFv-PE40在大肠杆菌中的表达

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

实验二 重组免疫毒素的亲和纯化及活性测定

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

结论

参考文献

附录

致谢

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