抗人乳腺癌重组免疫毒素MG/ScFv-PE40的原核表达及活性研究

摘要

将已构建好的抗人乳腺癌基因工程抗体免疫毒素M<,4>G<,3>/ScFv-PE40基因进行原核表达,并对诱导表达条件、表达量、包涵体的分离纯化、溶解和复性进行探索,得到重组蛋白M<,4>G<,3>/ScFv-PE40,Western blot证实其符合重组蛋白的结构要求,进而研究其对人乳腺癌细胞的靶向作用及其体外细胞杀伤活性,从而为乳腺癌的生物治疗提供新的手段奠定实验基础.方法:1、表达体系的构建:将M<,4>G<,3>/ScFv-PE40用NcoⅠ、HindⅢ从T载体上双酶切下来,与同样双酶切后的载体pET26b(+)相连,转化克隆菌株DH5 α,酶切鉴定正确后转化BL21(DE3)溶原菌;2、优化表达目的蛋白及鉴定:以不同浓度的IPTG诱导ScFv-PE40表达,做SDS-PAGE凝胶电泳分析其分子量大小、表达量,Western blot证实其符合重组蛋白的结构要求;3、ScFv-PE40的复性:大量表达目的蛋白,进行包涵体的分离纯化、溶解和复性探索;4、ScFv-PE40活性研究:设计体外细胞亲和性实验及体外细胞毒实验以研究其对人乳腺癌细胞的靶向作用及其体外细胞杀伤活性.结论:1、成功制备抗人乳腺癌基因工程抗体免疫毒素M<,4>G<,3>/ScFv-PE40.2、重组免疫毒素M<,4>G<,3>/ScFv-PE40对T47D人乳腺癌细胞有较好的靶向细胞杀伤作用,有可能成为乳腺癌治疗的有效途径.

目录

摘要

ABSRACT

1.前言

2.主要材料、仪器及试剂

2.1主要材料

2.2主要仪器

2.3主要试剂

3.实验步骤

3.1步骤图

3.2表达载体的准备

3.3插入片段的准备

3.4将插入片段克隆到表达载体上

3.5转化表达宿主菌BL21(DE3)

3.6目的蛋白的优化表达及鉴定

3.7 M4G3/SCFV-PE40的表达及复性

3.8 M4G3/SCFV-PE40免疫学鉴定(WESTERN BLOT实验)

3.9 M4G3/SCFV-PE40体外细胞亲和性实验

3.10 M4G3/SCFV-PE40体外细胞毒实验(MTT实验)

4.结果与分析

4.1表达载体PET26B(+)-M4G3/SCFV-PE40的构建

4.2转化表达宿主菌

4.3重组蛋白的表达、纯化及鉴定

4.4 M4G3/SCFV-PE40免疫学鉴定(WESTERN BLOT实验)

4.5 M4G3/SCFV-PE40体外细胞亲和性实验

4.6M4G3/SCFv-PE40体外细胞毒实验(MTT实验)

5.讨论

5.1免疫毒素的研究现状

5.2免疫毒素M4G3/SCFv-PE40的原核表达

5.3活性蛋白的获得

5.4免疫毒素的活性研究

5.5创新与不足之处

6.小结

7.致谢

8.参考文献

个人简历