抑制维氏气单胞菌的鱼源益生芽孢杆菌的筛选及其初步应用

摘要

水产养殖集约化发展迅速，伴随而来的是水体环境恶化和细菌疾病的频繁出现，制约着养殖的生产效益和人与环境的可持续发展。芽孢杆菌作为常见的水产微生态制剂用于养殖水体净化，这类细菌产生细菌素样物质，并表现出广谱抗菌活性，能对革兰阳性菌和革兰氏阴性菌有良好的抑菌效果，其高产生物酶的特性也常用于工业生产。芽孢杆菌作为微生态制剂具有较高抗逆性，使之替代抗生素已经成为一种趋势，我国芽孢杆菌资源开发具有可观的前景。 本研究先应用高温水浴筛选疑似芽孢杆菌菌株，通过芽孢染色和革兰染色、生物分子和生理生化特性鉴定确定芽孢杆菌。以牛津杯扩散法抑菌能力作为益生芽孢杆菌初步筛选指标，筛选出对维氏气单胞菌等12株水产病原菌和大肠杆菌等10株食源性致病菌有广泛抑制能力的2株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis C-11、S-22）。测试中芽孢杆菌对29种抗生素表现出较高敏感性，意味着这两株芽孢杆菌不太可能成为抗生素抗性细菌。筛选出对纤维素、蛋白质、淀粉降解圈比值最高的菌株，查看胞外水解酶活性;体外模拟肠道实验在高温耐受、酸碱耐受、人工肠液耐受能力，筛选出有肠道存活能力的芽孢杆菌。 为评价筛选出的芽孢杆菌（Bacillus velezensis C-11、S-22）是否具对鱼有有效的益生作用。先通过小鼠和斑马鱼注射高剂量芽孢杆菌模拟急性中毒实验，在两株芽孢高达1×1010CFU/ml 浓度下实验小鼠并未发生死亡，验证了这两株芽孢杆菌的安全性。将芽孢杆菌添加入鱼粮对实验鲫鱼进行5周连续饲喂，饲喂后第0d、8d、15d、22d、29d和36d采取血液样品和脏器组织，对血清和脏器组织中免疫指标进行检测。通过维氏气单胞菌急性攻毒实验评估芽孢杆菌的保护作用。测试芽孢杆菌饲喂组白细胞吞噬活性呈上升趋势，用 ELISA 检测试剂盒检测血液中 IgM、IL-1β、IL-10、IFN-γ、TNF-α、ACP、AKP、SOD 和 LZM，结果表明服用芽孢杆菌的鲫鱼血清中检测到了较高水平的 IgM、IL-1β、IL-10、IFN-γ、TNF-α，同时血清中ACP、AKP、SOD和LZM活性均提高，初步说明了芽孢杆菌对鲫鱼的体液免疫有良好的刺激作用。实时荧光定量结果表明，两株芽孢杆菌对鲫鱼主要免疫组织的 IL-1β、IL-10、IFN-γ、TNF-α 细胞因子转录水平提高，促进机体前期炎症反应;在实验中发现服用芽孢杆菌鲫鱼肠道组织IL-1β、IL-10、IFN-γ、TNF-α 细胞因子转录水平均呈上升趋势，证明了芽孢杆菌能与肠道淋巴组织特殊位点结合，从而提高宿主的免疫反应水平（p<0.05）。2倍LD50的维氏气单胞菌TH0426株对鲫鱼进行攻毒后，饲喂芽孢杆菌的鲫鱼存活率明显高于对照组，且肠道组织切片显示肠绒毛相比较攻毒组保存完好，炎症反应程度低于攻毒组，表明芽孢杆菌作为益生菌具有一定免疫保护作用（p<0.05）。 综上所述，本实验通过芽孢杆菌益生和抑菌能力筛选出最优的菌株，这两株Bacillus velezensis C-11、S-22对动物安全性高，通过口服能够提高鲫鱼的免疫反应水平，提高机体各类酶的活性，提高机体表达促炎因子的表达水平和体液免疫应答能力，保护鲫鱼肠绒毛完整性，降低鲫鱼被维氏气单胞菌感染后的病死率。最为重要的是，将Bacillus velezensis C-11、S-22作为饲料添加，促进淡水鱼的生长和控制疾病具有广阔的应用前景和实践意义。

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