Ⅱ型猪圆环病毒ORF2基因的毕赤酵母真核表达载体的构建及其表达

摘要

猪圆环病毒是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原，除PMWS之外，与许多猪相关疾病的发生有关，如猪皮炎与肾炎综合征(PDNS)、增生性坏死性肺炎(PNP)、猪呼吸道综合征(PRDC)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病，并且这些相关联的猪的疾病已在全世界范围内发生和流行，死亡率10-30％不等。较严重的地区，猪场在暴发本病时死淘率高达40％左右，其危害和造成的重大经济损失显而易见，现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为本病是继猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)之后新发现的重要的猪传染病。因此如何防制该病和尽早检测该病已成为养猪生产面临的新问题。 猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，无囊膜，二十面体对称，核酸为共价闭合、环状、单股DNA病毒。研究表明，PCV1和PCV2均含有两个主要的开放阅读框，即ORF1和ORF2。其中ORF1编码病毒的复制相关蛋白(ReP蛋白)，是PCV1、PCV2产生抗原交叉性的主要蛋白质。ORF2编码病毒的主要结构蛋白(Cap蛋白)，是PCV1、PCV2的主要保护性抗原，在PCV1与PCV2间不发生交叉反应，只有PCV20RF2蛋白可以被PCV2多抗识别。因而该蛋白可以作为检测PCV2抗体的有力诊断工具.毕赤酵母表达系统兼具有原核和真核表达系统的优点，不仅容易操作、耗时短、培养基廉价，而且最显著特点为毕赤酵母易于高密度发酵，表达水平相当高，另外，酵母细胞具有对表达产物进行类似真核细胞的蛋白加工、折叠和翻译后修饰等优点，而且在分泌表达外源蛋白过程中，毕赤酵母本身几乎不分泌蛋白，所以杂蛋白少，使表达蛋白利于纯化。因而，毕赤酵母为表达重组蛋白提供了一个良好的真核表达环境，可以使蛋白基因得到高效的表达并且特异性高，从而应用在猪圆环病毒病的快速诊断当中。 在本研究中，根据GeneBank中猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)序列，设计1对引物，并以提取的包含PCV2全基因组的DNA为模板，扩增出含ORF2基因的片段(675 bp)，回收PCR产物，将其克隆入pMD-18T载体，获得重组质粒pMD-ORF2，通过酶切鉴定和PCR鉴定，证实了所克隆的基因与目的基因大小一致。重组质粒经SnaBⅠ和AvrⅡ双酶切，回收ORF2基因，与真核表达载体pPIC9K进行连接、转化、克隆鉴定。然后，通过电转化法将经SalⅠ酶切线性化的pPIC9K-ORF2质粒转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中，利用甲醇诱导表达，经SDS-PAGE和Western-blot免疫印迹分析电泳分析。结果表明成功的获得了吉林株PCV2病毒的ORF2部分基因，获得了完整开放阅读框架，其大小为675bp，编码225个氨基酸，在143～145位存在着一个糖基化位点。成功的构建出了含有目的基因的重组真核表达质粒pPIC9K-ORF2，真核表达载体构建成功。获得了分子量约为40KDa的蛋白条带，说明构建的重组表达质粒pPIC9K-ORF2在毕赤酵母中成功表达

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1猪圆环病毒(PCV)概述

2猪圆环病毒分子生物学进展

3流行病学

4诊断方法

5防制

6研究的目的与意义

实验一Ⅱ型猪圆环病毒ORF2部分基因的克隆与测序

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

实验二真核重组表达质粒(pPIC9K-ORF2)的构建及表达

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

结 论

参考文献

致 谢

作者简历