鲤鱼β-防御素对锦鲤疱疹病毒重组质粒免疫效果的研究

摘要

防御素是一类可杀死细菌、真菌和病毒等微生物的多肽，是天然免疫系统的重要组成部分，具有反应时间快，耐药性，广谱抗菌活性等优点。作为第一道防线抵抗病原微生物的入侵，防御素迅速消灭细菌、真菌和病毒等微生物，对于防御外界病原微生物的侵害具有重要作用。 锦鲤疱疹病毒（Koi Herpesvirus，KHV）又称鲤疱疹病毒3型（CyHV-3），属疱疹病毒科，能够引发锦鲤疱疹病毒病（Koi Herpesvirus Diease，KHVD）。该病发病迅速，死亡率较高。锦鲤疱疹病毒有多个开放阅读框已被研究，并且具有一定的免疫性，但效果一直不佳，因此，本研究利用鲤鱼 β-防御素(BD)和锦鲤疱疹病毒重组质粒进行联合免疫，从而得到理想的免疫效果。 本研究根据GenBank登录的β-防御素的ID JF343439序列，利用软件设计特异性引物，通过提取RNA，RT-PCR克隆获得204 bp的β-防御素基因，并进行生物信息学分析。同时根据 GenBank 登录的锦鲤疱疹病毒 ORF56、ORF150 DNA序列，设计两对特异性引物，通过提取病毒 DNA，PCR 克隆获得 930 bp的ORF56基因和849 bp的ORF150基因。将三段基因分别插入到pMD18-T载体中，通过PCR和双酶切鉴定后，确定重组质粒pMD18-T-BD、pMD18-T-ORF56、pMD18-T-ORF150构建成功。经测序，结果表明，成功克隆目的基因片段。 本研究分别将三段基因与真核表达载体 PVAX 连接，成功构建重组质粒PVAX-BD、PVAX-ORF56、PVAX-ORF150。将三种重组质粒转染鲤鱼肌肉细胞，通过倒置显微镜观察发现荧光，表明成功构建重组质粒。 以多种免疫剂量的重组质粒对鲤鱼进行肌肉注射，每周免疫一次，共免疫三次，对实验鱼进行采血，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体水平，结果显示：PVAX-BD能增强PVAX-ORF56、PVAX-ORF150联合免疫效果。

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