苏云金芽孢杆菌cry1Ac与蛛毒蛋白酶抑制剂基因hwtx-11融合表达及其功能研究

摘要

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称 Bt)是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物。但是野生型的Bt菌株存在杀虫谱窄、毒力低等缺点，因此必须通过现代分子生物学技术构建高效广谱的Bt 工程菌来满足生产的需要。本研究利用融合基因技术将苏云金芽孢杆菌crylAc基因与蛛毒蛋白酶抑制剂基因hwtx-11融合获得了毒力高、杀虫谱广的工程菌株，并且对其功能进行了初步的研究。 1．crylAc基因与蛛毒蛋白酶抑制剂基因hwtx-11 融合基因的构建 利用Bt偏爱密码子优化设计虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)蛛毒蛋白酶抑制剂基因hwtx-11和肠激酶位点序列(Enterokinase site，简称EK site)，然后进行化学合成。对合成片段进行磷酸．化退火连接，与经Bgl Ⅱ和MifeⅠ双酶切的含crylAc的目的片段相连接，获得pUA11中间质粒，经SalⅠ和BamHⅠ双酶切，将融合基因片段克隆进穿梭载体pHT315中，获得表达载体pHA11。将表达载体pHA11电转化无晶体突变株Cry<'->B，获得重组菌株BHA11。同样，将携带crylAc基因的表达载体pHAc电转化无晶体突变株Cry<'->B，获得对照株BHAc。经SDS-PAGE和Westem blot分析，CrylAc-HWTX-11 融合蛋白在无晶体突变株中得到表达，其相对分子量约为136.6 kDa。对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hubner)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫进行的生测结果显示，BHA113d的LC<,50>值分别为12.3μg/ml和23.7μg/ml，BHAc 3d的LC<,50>值分别为19.1μg/ml和30.6μg/ml，BHA11菌株的杀虫毒力是BHAc菌株的1.6倍和1.3倍。 2.CrylAc C-端缺失对融合表达的影响 将携带融合基因的pHA11质粒进行Xho Ⅰ和Bgl/Ⅱ酶切，然后分别用 T4 DNA 聚合酶和绿豆芽核酸酶补平，构建缺失1.7kb crylAc C-端的重组质粒 pHA11T。将表达载体 pHA11T 电转化无晶体突变株Cry<'->B，获得重组菌株 BHA11T。经 SDS-PAGE 和 Western blot 分析，pHA11T在无晶体突变株中得到表达，BHA11T表达的融合蛋白相对分子量约为74.3 kDa。生测结果显示，BHA11T对甜菜夜蛾和棉铃虫幼虫具有杀虫活性，其LC<,50>值分别为34.7μg/ml 和 63.7μg/ml，与BHAc 菌株相比，BHA11T 菌株毒力分别降低了0.8倍和1.1倍。 3.CrylAc与蛋白酶抑制剂HWTX-11 的协同作用 将化学合成的蛛毒蛋白酶抑制剂基因 hwtx-11 克隆至载体pGEX4T-1上，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组菌株在IPTG诱导下，经SDS-PAGE和Western blot分析表明，表达的GST-HWTX-11 融合蛋白的相对分子量约为33 kDa。对重组菌株诱导表达后的产物进行生物活性测定，GST-HWTX-11 融合蛋白对甜菜夜蛾和棉铃虫在3d时的LC<,50>分别为86.6μg/ml 和 119.4μg/ml；其与CrylAc 对甜菜夜蛾和棉铃虫幼虫毒力也有明显的协同作用。 为了在苏云金杆菌中高效表达crylAc和hwtx-11的融合基因，本研究在实验设计上进行了多重优化。首先，采用crylAc基因的BtⅠ、BtⅡ双重叠启动子来启动融合基因的表达。该启动子是苏云金杆菌中最普遍存在的一类强启动子，适合在无晶体突变株Cry<'->B中启动融合基因的表达。其次，我们保留了crylAc基因终止子下游区中的茎环结构和Poly (T)结构。该结构在转录过程中能有效终止转录并使mRNA更稳定，延长rnRNA的半衰期，保证了融合蛋白高效稳定的表达。同时，为了将真核来源的hwtx-11基因在Bt中表达并发挥作用，我们采用Bt偏爱密码子对hwtx-11的编码序列进行优化设计，并在融合基因间插入了肠激酶位点的编码序列，以使融合蛋白在昆虫中肠能降解成有活性的CrylAc 和HWTX-11 蛋白。此外，本研究构建了重组菌株BHA11T来研究CrylAc C-端对融合蛋白表达的影响。生测结果显示其毒力比对照菌株BHA11有所降低，可能是因为CrylAc C-端富含半胱氨酸，而缺失CrylAc C-端的融合蛋白在表达时，不能形成二硫键，不能很好地形成晶体，从而很容易被降解。研究了HWTX-11与CrylAc的协同作用，它们之间具有良好的协同作用，这是由于它们的杀虫机制不同，大大提高它们的杀虫活性。本研究为构建Bt cry基因和其它外源毒素基因的融合基因以及构建高毒力的工程菌株奠定了重要的基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

引言

1.苏云金芽孢杆菌概述

2.苏云金芽孢杆菌毒素

3.苏云金芽孢杆菌ICPs基因

3.1 ICPs基因的存在模式

3.2 ICPs基因的命名与分类

3.3 cry基因的表达调控机制

4.苏云金芽孢杆菌杀虫伴孢晶体蛋白的作用机理

4.1伴孢晶体蛋白的结构

4.2伴孢晶体蛋白的作用机理和模型

5.苏云金芽孢杆菌的研究应用现状

5.1昆虫抗性机理研究和抗性管理

5.2定点突变研究

5.3利用转座子构建重组质粒和重组菌株研究

5.4转cry基因植物的研究

5.5融合基因的研究

5.6 Bt工程菌的研究

6.蛛毒蛋白酶抑制剂基因hwtx-11的概述

7.立题依据和意义

材料与方法

1.材料

1.1菌株与质粒

1.2培养基和抗生素

1.3试剂和引物

1.4仪器设备

2.方法

2.1融合基因的构建

2.2融合基因在Cry-B中的表达

2.3 hwtx-11在BL21(DE3)中的克隆表达

2.4生测

结果与分析

1.cry1Ac-hwtx-11融合基因的构建

1.1优化设计hwtx-11序列

1.2中间重组质粒pUA11的构建

1.3 cry1Ac-hwtx-11融合基因的构建路线

2.cry1Ac-hwtx-11融合基因在CryB中的表达

2.1融合基因表达载体的构建

2.2表达载体pHA11、pHA11T电转化CryB和鉴定

2.3融合蛋白的SDS-PAGE及Western blot分析

2.4重组菌株的生测分析

3.hwtx-11在BL21(DE3)中的克隆表达

3.1 hwtx-11在大肠杆菌中的克隆

3.2 BL21(pGEX4T-1/hwtx-11)重组菌株的诱导表达及检测

3.3 HWTX-11蛋白生物活性测定

讨论

1.cry1Ac-hwtx-11融合基因的构建和表达策略

2.Cry1Ac C-端的缺失对融合表达的影响

3.HWTX-11与Cry1Ac的协同作用

4.Bt工程菌株的杀虫机理及安全性探讨

结语

参考文献

附录

致谢