金针菇多糖通过TLR4和MR介导的MAPK/NF-κB通路诱导RAW264.7细胞免疫应答

摘要

金针菇（Flammulina velutipes）是一种常见的食用真菌;具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等生物活性。多糖是金针菇最重要的活性物质之一。金针菇多糖（Flammulina velutipes polysaccharide;FVP）的免疫调节活性已有相关的研究和报道;但关于巨噬细胞上金针菇多糖的受体的研究却相对较少。因此;本研究的目的是使用金针菇多糖（FVP）处理小鼠单核巨噬细胞RAW264.7;探究RAW264.7细胞上FVP受体和FVP发挥免疫调节作用的机制;以期为金针菇多糖免疫调节功能的研究提供一定的实验基础和理论依据。 研究方法：使用MTT法检测FVP对RAW264.7细胞活性的影响;中性红法检测FVP对RAW264.7细胞吞噬活性的影响;显微镜观察FVP处理后细胞形态变化;Griess法检测RAW264.7细胞分泌NO水平;ELISA法检测RAW264.7细胞培养上清中细胞因子（TNF-α和IL-1β）水平;荧光显微镜和流式细胞术检测RAW264.7细胞上FVP受体;qPCR法检测免疫相关因子iNOS、TNF-α和IL-1βmRNA以及TLR4和MR mRNA表达水平;Westernblot法检测β-actin、TLR4、MR、ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK、p-JNK、IκBα、p-IκBα、p65蛋白表达水平;免疫荧光法检测p65核易位情况。 实验结果如下： 1. 12.5、25、50和100μg/mL的FVP对RAW264.7细胞无细胞毒性;12.5μg/mL FVP处理组能够显著促进RAW264.7细胞增殖;因此选择12.5-100 μg/mL浓度范围的FVP进行后续实验。 2. 中性红实验结果显示12.5μg/mL FVP能够增强RAW264.7细胞的吞噬活性;倒置显微镜下观察到FVP处理后RAW264.7细胞形态由静息变为激活状态;FVP以剂量依赖的方式促进RAW264.7细胞分泌NO和IL-1β;上调iNOS和IL-1βmRNA 的表达;TNF-α 的分泌和 mRNA 的表达呈先升高后降低的趋势;在 50μg/mL时达到最高值。 3. FVP能够与RAW264.7细胞结合;TLR4和MR的受体抑制剂不仅可以抑制二者结合;还可以抑制FVP诱导的RAW264.7细胞分泌NO、TNF-α和IL-1β。此外;高浓度的FVP可以显著上调TLR4 mRNA和蛋白的表达;各浓度的FVP均能显著上调MR蛋白表达;而MR mRNA的表达也呈一定的增加趋势。 4. FVP能够激活RAW264.7细胞中MAPK信号通路;p-ERK1/2和p-p38蛋白表达在FVP处理15 min时达到最高;p-JNK蛋白表达的增加可持续至30 min;FVP以浓度依赖的方式增加ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平;p38的磷酸化程度先升高后降低;在50 μg/mL时p-p38的蛋白表达量最高;MAPK抑制剂能显著抑制FVP诱导RAW264.7细胞分泌NO、TNF-α和IL-1β;其中JNK的抑制剂SP600125的抑制效果最好。 5. FVP刺激RAW264.7细胞中IκBα蛋白磷酸化;NF-κB信号通路被激活; Westernblot和免疫荧光实验结果显示FVP促进p65核易位;NF-κB抑制剂对FVP诱导的RAW264.7细胞免疫反应有显著抑制作用。 结论：FVP通过TLR4、MR/MAPK/NF-κB信号通路激活RAW264.7细胞产生免疫应答。本研究不仅揭示了巨噬细胞上金针菇多糖的受体及其发挥免疫调节作用的机制;也为金针菇多糖免疫调节功能的研究提供一定的实验基础和理论依据。

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