转茶陵野生稻三个耐冷候选基因拟南芥的创制及其表型分析

摘要

湖南茶陵普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)是两个北缘野生稻居群之一，前人的研究表明其耐冷性很强。克隆其耐冷相关基因，不仅能给栽培稻的耐冷转基因分子育种提供目的基因资源，而且可增进我们对野生稻耐冷分子机制的认识，具有重要价值。
　　OrCr、OrCr2及OrCr3(Oryza rufipogon cold responsive gene 1,2,3)是采用水稻全基因组表达芯片分析以及生物信息学分析从茶陵野生稻中鉴别出的3个受低温诱导而显著上调的耐冷候选基因。
　　为了探明这3个耐冷候选基因是否具有耐冷作用或其它作用，通过农杆菌介导法转化了拟南芥，获得了转OrCr1，2，3基因拟南芥植株，并筛选出纯系。
　　对获得的转OrCr1，2，3基因拟南芥纯系的耐逆性进行了鉴定，初步结果如下:
　　1)转OrCr1，2,3基因拟南芥经过4℃低温处理20d后其发芽率高于野生型，幼苗的生长势强于野生型;
　　2)转OrCr1，2，3基因拟南芥经过43℃处理3h后生长势与野生型无显著性差异;
　　3)转OrCr3基因拟南芥在150mM NaCl条件下生长10d的发芽率与根系长势高于或强于野生型，而转OrCr1，2基因拟南芥与野生型发芽率与根系长势无显著差异;
　　4)在渗透胁迫（300mM甘露醇培养基中萌发10d）下，转OrCr3基因拟南芥发芽率明显低于野生型并且根长短于野生型，而转OrCr1，2基因拟南芥与野生型发芽率与根系长势无显著性差异;
　　5)在0.4μM-0.8μM脱落酸处理下，转OrCr1，2，3基因拟南芥植株均增加对脱落酸的敏感性，尤其在0.8μM脱落酸中，转OrCr1，2,3基因拟南芥几乎不萌发，而野生型正常萌发;随着脱落酸处理浓度的升高，根系长度逐渐降低或者不萌发，而到0.8μMABA时，转OrCr1，2,3基因拟南芥根几乎不生长，而野生型拟南芥根系长度稍微低于正常条件下的拟南芥根长。
　　以上结果说明:OrCr1，2，3基因在拟南芥中异位表达能提高拟南芥的耐冷性与对外源ABA的敏感度，此外，OrCr3基因能够提高拟南芥的耐盐性，但不能提高拟南芥的耐渗透胁迫能力。

目录

摘要

1 前言

1．1 克隆水稻耐逆基因的重要价值

1．2 国内外植物耐冷性相关研究进展

1．2．1 植物低温伤害分类

1．2．2 植物抗寒的生理基础

1．2．3 保护物质增多

1．2．4 低温胁迫信号的转导

1．3 国内外关于水稻耐冷性的分子机理研究进展

1．4 植物耐盐机理

1．5 研究目的以及意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株与质粒载体

2．1．3 培养基

2．1．4 常用试剂

2．1．5 主要仪器

2．1．6 关于生物信息学分析所需数据库和软件

2．2 实验方法

2．2．1 农杆菌GV3101的转化(电击法)

2．2．2 大肠杆菌TOP10的感受态细胞的制备

2．2．3 热激转化

2．2．4 菌落PCR检测阳性克隆菌株

2．2．5 质粒的提取

2．2．6 OrCr1，OrCr2，OrCr3序列分析

2．2．7 拟南芥的遗传转化

2．2．8 转基因拟南芥表型分析

3 结果与分析

3．1 pCAMBIA1300-OrCr1／2／3双元表达载体的真实性鉴定

3．2 pCAMBIA1300-OrCr1／2／3对农杆菌GV3101的转化

3．3 pCAMBIA1300-OrCr1／2／3对拟南芥的转化

3．3．1 潮霉素抗性拟南芥植株筛选

3．3．2 pCAMBIA1300-OrCr1／2／3转基因拟南芥的分子鉴定

3．4 转OrCr1，OrCr2与OrCr3基因拟南芥表型分析

3．4．1 转OrCr1，OrCr2与OrCr3基因拟南芥耐冷性分析

3．4．2 转OrCr1，OrCr2与OrCr3基因拟南芥耐热性分析

3．4．3 转OrCr1，OrCr2与OrCr3基因拟南芥耐盐性分析

3．4．4 转OrCr1，OrCr2与OrCr3基因拟南芥耐旱性分析

3．4．5 转OrCr1，OrCr2与OrCr3基因拟南芥对ABA的敏感性分析

4 讨论

参考文献

致谢

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