利用斑马鱼模型研究HFHG45基因在血祖细胞形成与分化中的作用

摘要

在胚胎发育过程当中，血液与血管都起着重要的作用。人类许多疾病的发生都与血液或血管发育异常有密切联系。血液与血管起源于同一种细胞，称之为血祖细胞。血祖细胞来源于中胚层，它会分化形成血液祖细胞以及血管祖细胞。血液祖细胞产生的原始血细胞参与初级造血，而血液祖细胞形成的造血干细胞调控次级造血产生成熟的红细胞、髓系细胞以及淋巴细胞。血管祖细胞主要分化为血管内皮细胞，最后形成动脉、静脉和淋巴血管等。血液与血管的整个发育进程是在繁杂而精密的分子信号网络的调控下进行的，任何关键分子调控异常都可能会导致严重的发育缺陷或重大疾病。到目前为止，调控造血体系与血管体系发育的分子机制不是非常清楚，因此研究血液与血管发育进程的关键分子有助于完善血液与血管发育过程的分子信号网络，从而对有关疾病的治疗提供新的分子靶点和治疗方案。
　　本文利用模式生物斑马鱼，研究一个尚未有功能报道的新基因HFHG45对血祖细胞的形成与分化的影响。为了探究HFHG45基因的时空表达谱，分别对斑马鱼发育各个时期的胚胎进行原位杂交和RT-PCR，分析结果表明:HFHG45在斑马鱼中广泛表达且高表达于血液血管处。为了更加直观观察HFHG45的表达情况，建立HFHG45启动子绿色荧光转基因斑马鱼品系TG(HFHG45:egfp)，分析结果发现:表达绿色荧光区域基本与原位杂交探针表达区域接近。研究HFHG45蛋白表达情况，制备了斑马鱼HFHG45多克隆抗体，Western-blot结果显示:HFHG45蛋白在斑马鱼胚胎发育的各时期均表达;在成年斑马鱼的心脏、血液、脑和肌肉组织有表达且在血液中的表达较强烈，这些结果提示:HFHG45基因可能与斑马鱼血液发育有关。利用斑马鱼HFHG45基因特异性的morpholino反义寡核酸敲减其表达，发现斑马鱼血管与血液发育异常。为了深入研究HFHG45基因的生物学功能，运用TALEN敲除技术得到3个斑马鱼HFHG45基因的敲除品系，敲除系F2代致死分析表明HFHG45基因敲除纯合子突变致死;敲除系的表型分析发现斑马鱼节间血管、尾部动脉和静脉发育受到抑制以及血细胞数目明显减少。以上结果表明HFHG45基因在斑马鱼血液与血管形成中起着十分重要的作用。
　　该基因是怎样影响斑马鱼血液与血管发育的呢？首先研究HFHG45基因是否影响斑马鱼的初级造血。胚胎原位杂交检测血液标志基因scl、 mpx、 lcp1和hbbe3;原始红细胞祖细胞标记性基因gata1;原始髓系细胞祖细胞标记基因pu.1均在HFHG45敲除纯合子中表达显著下调，O-Dianisidine染色显示HFHG45敲除纯合子血红蛋白表达减少。这些结果表明:HFHG45是直接调控原始的血细胞发育的。接下来研究 HFHG45对斑马鱼次级造血的影响。淋巴祖细胞标记基因rag1原位杂交结果显示:在斑马鱼HFHG45敲除纯合子中几乎没有rag1的表达，成熟髓系细胞数目减少。通过中性红与苏丹黑染色发现，髓系细胞分化形成的巨噬细胞和中性粒细胞的数目都受到了影响。cmyb等造血干细胞标记基因的原位杂交以及在TG(cmyb:egfp,kdrl:mCherry)双转基因斑马鱼中敲除HFHG45表达分析发现，其背部主动脉中没有造血干细胞标记cmyb的绿色荧光与内皮细胞标记kdrl的红色荧光共表达的细胞，实验证明HFHG45敲除纯合子中起源于背部主动脉中的内皮细胞没有正常形成造血干细胞。因此，可以说明:HFHG45是斑马鱼次级造血所必需的。为了研究HFHG45对斑马鱼血管内皮细胞的影响，利用TG(flila:egfp）与TG（kdrl:mCherry）2种转基因斑马鱼品系，敲除HFHG45基因的情况下分析斑马鱼血管的发育情况，其荧光表达直观清楚地显示敲除HFHG45导致斑马鱼节间血管、尾部主动脉和静脉的形成受到明显抑制。内皮细胞标记基因flk1、tie2和flila等原位杂交结果显示HFHG45基因敲除纯合子中它们的表达均显著减少。这些结果说明:HFHG45基因在斑马鱼血管的形成中起着重要的作用。
　　已知斑马鱼血细胞和血管内皮细胞都起源于血祖细胞，那么HFHG45基因是否直接影响血祖细胞的发育从而影响血液与血管的发育呢？血祖细胞标记基因scl、 gata2、etv2和gata5原位杂交发现敲除HFHG45基因的斑马鱼胚胎，血祖细胞的发育与分化受到严重影响。实验结果说明:HFHG45基因是通过影响血祖细胞的形成，进而影响血细胞和血管内皮细胞的形成。
　　在HFHG45基因敲除斑马鱼中，研究还发现72h斑马鱼心脏出现了环化的异常。斑马鱼心脏生理学分析发现，斑马鱼的心脏功能受到了影响。那么HFHG45基因是直接参与调控斑马鱼心脏的发育还是由于血液与血管的异常发育造成的间接影响呢？心脏早期标记基因的RT-PCR结果表明，敲除HFHG45基因对心脏祖细胞标记基因nkx2.5、tbx5等表达没有显著变化。心房标记基因amhc、心室标记基因vmhc、心脏标记基因myl7和bmp4的原位杂交结果也显示这些基因的表达没有改变。综上所述结果推测，HFHG45基因可能是间接调控斑马鱼的心脏发育。
　　本论文研究结果表明，斑马鱼HFHG45基因是控制血祖细胞形成与分化的必需调控因子。它参与调控斑马鱼造血系统与血管系统的发育，是调控血祖细胞形成与分化的调控网络的源头基因。阐明该基因的分子调控机制，将有助于完善脊椎动物血液与血管发育过程的分子信号网络，可能为今后临床治疗由血祖细胞发育引起的疾病提供新的治疗靶位点。

目录

摘要

第一章 研究背景和文献综述

1．1 脊椎动物造血过程

1．1．1 脊椎动物血液成分及功能

1．1．2 人类与斑马鱼血细胞形态比较

1．1．3 脊椎动物造血发育

1．2 斑马鱼造血系统

1．2．1 斑马鱼研究造血优势

1．2．2 斑马鱼初级造血

1．2．3 斑马鱼次级造血

1．2．4 斑马鱼造血干细胞

1．2．5 血祖细胞

1．3 斑马鱼血管发育

1．3．1 血管内皮细胞

1．3．2 成熟血管组织

1．4 调控造血信号通路及其相关基因

1．4．1 调控初级造血的调控因子

1．4．2 参与次级造血的调控因子

1．4．3 调控造血的信号通路

1．5 调控血管形成的信号通路及其调控因子

1．5．1 影响尖端细胞形成的信号通路及其调控因子

1．5．2 影响柄细胞形成的信号通路及其调控因子

1．5．3 影响砋细胞形成的信号通路及其调控因子

1．6 本文研究意义

第二章 材料与方法

2．1 材料、试剂与设备

2．1．1 酶类、试剂盒以及抗体

2．1．2 菌株和质粒

2．1．3 其他试剂

2．1．4 主要实验仪器

2．1．5 生物信息学分析的主要软件与数据库

2．2 常规分子生物学实验方法

2．2．1 分子克隆

2．2．2 Anti-sense RNA的转录及探针合成

2．2．3 总RNA的提取

2．2．4 斑马鱼morpholino技术

2．2．5 显微注射

2．2．6 基因全长capped mRNA的体外转录

2．2．7 RNA纯化

2．2．8 斑马鱼整体原位杂交

2．2．9 斑马鱼整体胚抗体染色

2．2．10 斑马鱼心脏剥离以及抗体染色技术

2．2．11 斑马鱼心率分析技术

2．2．12 O-Dianisidine染色

2．2．13 中性红染色

2．2．14 苏丹黑染色

2．2．15 TUNEL染色

2．2．16 EDU染色

2．2．17 原核细胞诱导蛋白质表达及多克隆抗体制备

2．2．18 TALEN敲除技术

第三章 结果与讨论

3．1 斑马鱼HFHG45基因表达的初步研究

3．1．1 HFHG45在原核细胞中的表达及多克隆抗体的制备

3．1．2 HFHG45在斑马鱼胚胎中的表达和定位

3．2 TG(HFHG45：EGFP)转基因斑马鱼的构建

3．2．1 HFHG45：EGFP重组质粒的构建

3．2．2 HFHG45：EGFP转基因斑马鱼的建立

3．3 敲低HFHG45基因斑马鱼血液血发育异常

3．3．1 HFHG45基因morpholino有效性验证

3．3．2 HFHG45基因敲减表型分析及统计

3．3．3 敲减HFHG45基因斑马鱼节间血管异常

3．3．4 敲减HFHG45基因斑马鱼血红蛋白表达减少

3．4 建立HFHG45基因完全敲除斑马鱼品系

3．4．1 TALEN敲除斑马鱼HFHG45基因质粒的构建

3．4．2 斑马鱼HFHG45基因敲除品系的建立

3．4．3 斑马鱼HFHG45基因敲除表型的分析

3．4．4 斑马鱼HFHG45基因敲除死亡率统计

3．5 HFHG45基因是斑马鱼初级造血所必需的

3．5．1 HFHG45基因直接调控原始红细胞发育

3．5．2 HFHG45基因直接调控原始髓系细胞发育

3．6 HFHG45基因是斑马鱼次级造血所必需的

3．6．1 HFHG45基因影响参与调控成熟血细胞形成

3．6．2 HFHG45调控次级造血是通过调控造血干细胞实现

3．7 HFHG45基因影响斑马鱼内皮细胞的生成

3．8 HFHG45基因影调控斑马鱼造血祖细胞的发育

3．9 HFHG45基因通过抑制增殖以及加速细胞凋亡共同作用

3．10 HFHG45基因对于心脏的调控可能是间接的

3．11 讨论

第四章 结语

参考文献

附录一

附录二 专业名词缩写词简表

附录三 攻读学位期间发表的主要论文及主持的课题

致谢

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