麻痹性贝类毒素细胞检测法的建立与评价

摘要

目的:麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning，PSP)因人食用了含有该毒素的贝类会引起人体产生外周神经麻痹而得名。其特点是广泛分布在世界的各个海域、毒性作用强、对人类致死率高等。PSP是一种钠离子通道阻断剂，对动物的心血管、神经系统有高度的特异性。到目前为止，对此类毒素并没有特效的解毒剂。国内外对PSP的检测建立了多种方法，但这些检测方法优缺点明显，我国目前采用的是国外进口的试剂盒检测，其检测成本较高不利于普及。所以，建立一种简便、灵敏、成本低适合普及的PSP检测方法是非常必要的。
　　方法:本研究以小鼠神经母细胞瘤N2a为受试对象，基于细胞毒性建立PSP酶联免疫检测方法，即细胞检测法。首先广泛搜集近15年来报道的全国发生麻痹性贝类毒素食物中毒事件，进行数据的整理和分析，对麻痹性贝类毒素食物中毒的流行病学分布进行探讨。然后使用蛋白质组学技术筛选出石房蛤毒素(STX)暴露N2a细胞中的差异蛋白，利用Western blot和相应的ELISA方法对差异蛋白进行进一步验证。利用差异蛋白建立检测PSP的细胞检测法，并对此方法分别从灵敏度、特异性和重复性方面进行评价。
　　结果:1、按照剔除标准和步骤进入统计分析的文献共21篇，共报道麻痹性贝类毒素食物中毒事件131起，889例，其中有69人死亡，病死率为7.76％。其中沿海地区共报道130起;第一季度报道3起，第二季度报道67起，第三季度报道59起，第四季度报道2起;食用织纹螺导致麻痹性贝类毒素中毒事件共124起，732例病人。2、与未暴露N2a细胞总蛋白相比，STX暴露N2a细胞总蛋白中共有13个差异蛋白点，经质谱鉴定后，这13个差异蛋白点为9个蛋白;进一步验证发现与未暴露的N2a细胞蛋白相比，小鼠14-3-3蛋白及小鼠α烯醇化酶在STX暴露N2a细胞蛋白中表达上调，小鼠丝切蛋白2在N2a细胞中表达下调。3、采用α烯醇化酶ELISA试剂盒对贝类样品进行检测，其检测结果与ELISA法检测结果相关性良好，R2=0.8106。
　　结论:1、麻痹性贝类毒素食物中毒事件的发生率沿海地区明显高于内陆地区;时间主要发生在第二、三季度;造成麻痹性贝类毒素食物中毒的主要食物是织纹螺。2、STX暴露N2a细胞可以使细胞中小鼠14-3-3蛋白和小鼠α烯醇化酶的表达上调，小鼠丝切蛋白2的表达下调。3、小鼠α烯醇化酶含量与STX浓度在1-10nmol/L范围内具有线性关系。在此基础上建立的PSP细胞检测法具有良好的特异性及重复性，检测限可达到1nmol/L，相当于0.299μg/100g。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 麻痹性贝类毒素的主要来源

1．2 麻痹性贝类毒素的理化性质

1．3 麻痹性贝类毒素的毒性

1．4 麻痹性贝类毒素的检测方法

1．5 本研究的意义及主要内容

第二章 麻痹性贝类毒素食物中毒流行病学分析

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 本章小结

第三章 STX暴露N2a细胞中差异蛋白的筛选及验证

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 本章小结

第四章 麻痹性贝类毒素细胞检测法的建立与评价

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 本章小结

结论与展望

本论文的创新之处

参考文献

综述

英文缩略词表

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢

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