埃博霉素异源表达工程菌株的构建及其生物合成产量的研究

摘要

埃博霉素(epothilone)是一类来源于纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)具有潜在抗肿瘤活性的16元大环内酯化合物，其作用机理与紫杉醇(paclitaxel)类似，通过稳定微管，阻滞微管解聚，使有丝分裂停留在中期，从而诱导肿瘤细胞凋亡。相比于紫杉醇，埃博霉素分子结构简单，水溶性更佳，抗肿瘤活性更强。但由于纤维堆囊菌生长缓慢，易受污染，导致埃博霉素目前价格高昂，严重限制了其临床应用，由于缺乏纤维堆囊菌的有效遗传操作手段，利用其他的原核宿主来实现埃博霉素的异源表达成为了研究的热点。但埃博霉素的生物合成机制复杂，相关基因簇为56 Kb之大，GC含量在60％以上，传统的分子生物学技术对埃博霉素基因簇难以进行有效的编辑。本实验室课题组利用Red/ET同源重组技术构建了埃博霉素基因簇的转座载体，并将其导入到伯克氏菌(Burkholderia)DSM7029的基因组中，筛选得到了一株能合成埃博霉素的基因工程菌株伯克氏菌DSM7029∷Tn5-km-epo，编号为G32。尽管本课题组成功的实现了埃博霉素的异源表达，但其产量不高，总产量仅为3.7μg/L。利用有效的遗传操作方法提高埃博霉素的异源表达产量成为了当务之急。
　　潜在的埃博霉素转运蛋白基因是位于埃博霉素基因簇外围的orf3与orf14两个开放阅读框编码的基因，对其氨基酸序列进行同源比对发现Orf3与Orf14可能是埃博霉素的跨膜运输载体蛋白，本研究探究了潜在的埃博霉素转运蛋白基因在G32中表达对产物中埃博霉素产量变化的影响，通过Red/ET同源重组技术构建埃博霉素转运蛋白基因表达载体，并将其转入基因工程菌株G32中，获得一株新的基因工程菌株G32∷orf14-orf3，通过HPLC/MS/MS检测，实验发现新的工程菌株埃博霉素产量比原始提高了1倍左右，结果表明，潜在转运蛋白基因的异源表达能有效促进伯克氏菌中埃博霉素的生物合成，为实现埃博霉素异源高效表达和探究潜在埃博霉素转运蛋白在埃博霉素次级代谢过程中的调控作用奠定了重要基础。
　　源自天蓝色链霉菌A3(2)的丙酰CoA羧化酶基因（scpccAB基因）能在胞内将丙酰CoA羧化合成埃博霉素B、D的重要延伸单元，甲基丙二酰CoA。本文研究了丙酰CoA羧化酶基因G32中表达对产物中埃博霉素产量变化的影响，通过Red/ET同源重组技术构建丙酰CoA羧化酶基因表达载体，并将其转入到基因工程菌株G32中，获得一株新的基因工程菌株G32∷ scpccAB，通过HPLC/MS/MS检测，实验发现新的工程菌株埃博霉素B、D的产量比原始提高了4倍左右，埃博霉素B、D所占的产物比例由原来的20％提高到了40％。结果表明，丙酰CoA羧化酶基因的异源表达能有效促进伯克氏菌中甲基侧链产物(B、D)的生物合成，增大其代谢通量，为实现埃博霉素异源高效表达和选择性生物合成研究奠定了基础
　　除以上两个基因，本研究还从增强转录，促进反应后修饰等方面，利用Red/ET同源重组技术构建7kb的epoK基因表达载体，60 kb的自杀型基因打靶载体和70 kb的埃博霉素基因簇与丙酰CoA羧化酶基因转座载体，为后续实验中进一步提高埃博霉素异源表达产量提供了研究基础。
　　本研究在伯克氏菌中对潜在转运蛋白基因和丙酰CoA基因进行了调控功能研究，利用定向遗传改造的方法成功构建了埃博霉素高产菌株，为实现埃博霉素异源高效表达和合成调控奠定了相关基础。

目录

摘要

1．1．1 埃博霉素概述

1．1．2 埃博霉素的结构及理化性质

1．1．3 埃博霉素的临床研究

1．1．4 埃博霉素的化学合成

1．1．5 埃博霉素的生物合成

1．1．6 通过异源表达和调控提高埃博霉素的产量

1．2 Red／ET重组工程

1．2．1 Red／ET重组工程简介

1．2．2 Red／ET重组的原理

1．2．3 RecE／RecT介导的多个片段的重组

1．2．4 诱导性启动子Ptet与PBAD

1．3 立题依据和意义

2．1 实验材料

2．1．1 供试菌株、质粒

2．1．2 培养基和抗生素

2．1．3 寡核苷酸合成和DNA测序

2．1．4 分子生物学试剂

2．1．5 DNA序列分析软件

2．1．6 仪器设备清单

2．2 基础分子生物学实验方法

2．2．1 革兰阴性细菌基因组DNA的制备

2．2．2 PCR(polymerase chain reaction)反应及产物纯化

2．2．3 酶切与T4连接酶连接体系

2．2．4 电转化方法

2．2．5 碱裂解法小提革兰阴性菌质粒方法和酶切鉴定反应体系

2．2．6 测序鉴定

2．3 伯克氏菌DSM7029重组子生长曲线测定

2．4 LLHR构建埃博霉素异源表达相关调控载体

2．4．1 构建潜在转运蛋白基因异源表达载体

2．4．2 三重LLHR构建丙酰CoA羧化酶异源表达载体

2．5 LCHR构建相关异源表达调控载体转座载体

2．5．1 构建epoK基因异源组成型表达载体

2．5．2 构建自杀型埃博霉素基因簇基因打靶载体

2．5．3 构建埃博霉素基因簇与丙酰CoA羧化酶基因转座载体

2．6 在基因工程菌株G32中导入埃博霉素调控基因表达载体

2．7 向基因工程菌株G32中转入自杀型基因打靶载体

2．8 伯克氏菌DSM7029的发酵流程与化合物的初提，鉴定

3．1 生长曲线测定结果

3．2 鉴定潜在埃博霉素转运蛋白过表达载体pRK2-apraR-orf14-orf3

3．3 鉴定scpccAB基因表达载体

3．4 鉴定epoK基因组成型表达载体

3．5 鉴定自杀型基因打靶载体

3．6 鉴定自杀型转座载体

3．7 利用基因打靶载体将埃博霉素基因簇插入到伯克氏菌基因组中

3．8 在伯克氏菌中检测潜在转运蛋白基因和丙酰CoA羧化酶基因

3．9 鉴定工程菌株发酵产物中的埃博霉素

3．10 比较基因工程菌株发酵产物中的各埃博霉素衍生物产量

第4章 讨论

4．1 伯克氏菌DSM7029中异源表达载体的构建与转化

5．1 结论

5．2 展望

致谢

参考文献

缩略表(中英文对照)

硕士期间发表的文章

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