rAAV6介导miR361-PSR下调心肌细胞PDE9A基因表达的体外研究

摘要

目的：构建包含心脏肌钙蛋白T启动子（cTnT启动子）和miR361-PSR(hCGin-miR361-PDE9AshRNA)表达框的重组质粒，包装6型重组腺相关病毒(rAAV6-cTnT-miR361-PSR)，体外转导原代心肌细胞，应用RNA干扰原理，下调PDE9A基因的表达，观察原代心肌细胞中PDE9A基因mRNA和蛋白水平的变化。
　　方法：⑴构建基于miRNA361骨架靶向下调PDE9A表达的shRNA片段（miR361-PSR片段），与质粒pAAV-cTnT-null进行双酶切(BamHⅠ、NotⅠ)，将得到酶切片段连接构成重组质粒pAAV-cTnT-miR361-PSR。⑵将pAAV-cTnT-miR361-PSR重组质粒、pAAV6包装质粒及辅助质粒，共转染293细胞，获得rAAV6-cTnT-miR361-PSR病毒。用SDS-PAGE测定病毒纯度和Dot Blot法测定病毒滴度。⑶重组病毒rAAV6-cTnT-miR361-PSR转导乳鼠原代心肌细胞，提取mRNA和蛋白质，用RT-PCR和Western Blot法测定PDE9A基因的表达水平的变化。
　　结果：①成功构建pAAV-cTnT-miR361-PSR重组质粒。②成功包装rAAV6-cTnT-miR361-PSR重组病毒。③rAAV6-cTnT-miR361-PSR重组病毒转导原代心肌细胞后PDE9A基因的mRNA和蛋白量均明显低于对照组。
　　结论：成功包装rAAV6-cTnT-miR361-PSR重组病毒体外转导原代心肌细胞，明显下调PDE9A基因和蛋白的表达。

目录

摘要

引言

第二章 材料和方法

2．1 材料

2．2 方法

第三章 结果

3．3 SDS-PAGE检测rAAV病毒纯度

3．4 Dot Blot检测rAAV病毒滴度

3．5 rAAV病毒的电镜分析

3．6 原代心肌细胞的培养

3．7 不同血清型rAAV病毒转导效率的验证

3．9 Western Blot检测PDE9A蛋白量

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述 心力衰竭基因治疗研究进展

主要缩写词表

在读期间发表的主要学术论文

致谢

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