雪峰虫草子座人工培养及其交配型基因的研究

摘要

虫草是寄生于昆虫、植物和少数真菌的一类真菌的总称，是真菌遗传学研究的好材料，其中许多种类属于名贵药材。雪峰虫草（Ophiocordyceps xuefengensis）为近年来发现的真菌新物种，它寄生于活体植物大青的根或者茎中的疖蝙蛾幼虫体上，仅在湖南雪峰山区有发现，是已知的最大的虫草，被证实是与冬虫夏草（O.sinensis）亲缘关系最近的物种。本论文对雪峰虫草无性型的生物学特性、人工培养条件、有效成分和交配型基因进行了研究。 (1)从野生雪峰虫草子座中分离获得菌株，从分离菌的培养特性、形态特征、分子水平（ITS区序列）等方面展开研究，并对分离菌进行人工培育，获得了雪峰虫草的子座，从而确定了雪峰虫草的无性型;交配型基因的分布检测结果表明:只有子囊含有两种交配型基因，证明雪峰虫草属于异宗配合真菌。 (2)以雪峰虫草菌作为出发菌株，在单因素实验的基础上，采用PB实验设计、最陡爬坡实验和中心组合实验优化发酵条件，并通过建立多项式数学模型，采用统计分析对模型进行显著性检验拟合出最佳发酵条件。在优化的条件下，发酵液中菌丝的生物量可达18.8g/L，相比单因素实验最适条件下菌丝的生物量16g/L，提高了17.5％。通过L9(34)正交试验确定了雪峰虫草子座的最佳培养条件为:固体基质20g、固体基质与子实体培养液比为1∶2(W/V)、接种量为3％、22℃培养15d（黑暗条件下），将组培瓶置于光照强度为20～40Lux，温度为19℃，培养60d后，子座干重达4.78g，转化率可达22％。这为进一步研究雪峰虫草的活性物质打下了坚实的基础。 (3)对雪峰虫草不同组织的主要活性成分进行了分析。采用高效液相色谱法(HPLC)系统分析了雪峰虫草不同组织中9种主要核苷类成分的含量，结果表明野生子实体中含腺苷最高(761.5mg/kg)，其次是人工培育的子座（721.2mg/kg）和发酵菌丝体(623.9mg/kg);发酵菌丝体中尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷和鸟苷的含量显着高于野生雪峰虫草样品;人工培育雪峰虫草中鸟苷的浓度也高于野生样品。人工培育的子座中腺苷的含量达到0.06％以上，远高于中国药典（2015版）规定天然虫草中腺苷的含量(＞0.01％)。雪峰虫草的3种不同组织（菌核、子座和菌丝体）中虫草酸含量分别为7.8％、11.7％和15.0％;其不饱和脂肪酸的相对含量分别是77.6％、66.1％和65.4％，菌核中的脂肪酸主要为油酸（单不饱和脂肪酸），人工子座和发酵菌丝体中脂肪酸主要为亚油酸（多不饱和脂肪酸）。3种不同组织中氨基酸含量分别为211.55mg/g、191.48mg/g和282.26mg/g;人体必需8种氨基酸含量分别为104.93mg/g、60.79mg/g和108.49mg/g。从核苷、虫草酸、脂肪酸和氨基酸水平来分析，雪峰虫草的发酵菌丝体和人工培育的子座可作为野生雪峰虫草的代品。 (4)对雪峰虫草交配型MAT1-1和MAT1-2基因座进行了克隆与分析。利用hiTAIL-PCR技术克隆了雪峰虫草交配型MAT1-1和MAT1-2基因位点全长序列，并通过Southern印迹杂交技术对hiTAIL-PCR克隆的交配型MAT1-1和MAT1-2基因位点中的基因进行检测和验证。结果表明:①雪峰虫草与已报道的冬虫夏草的交配型基因MAT1-1位点和MAT1-2位点内基因的构成方式相同。②雪峰虫草的MAT1-2位点上含有单个基因MAT1-2-1，且为单拷贝基因。③MAT1-1位点包含MAT1-1-3、MAT1-1-2和MAT1-1-1三个基因，且极可能为单拷贝位点。④交配型MAT1-1和MAT1-2位点的左侧共有序列上含有DNA lyase基因。⑤雪峰虫草MAT1-1-3基因编码区长728bp，含3个内含子，编码的多肽为192个氨基酸。MAT1-1-2基因编码区长1318bp，含3个内含子，编码的多肽为382个氨基酸;MAT1-1-1基因编码区长1220bp，含2个内含子，编码的多肽为371个氨基酸。MAT1-2位点仅包含MAT1-2-1基因，其编码区长855bp，有2个内含子，编码249个氨基酸。雪峰虫草交配型基因座中MAT1-1-3、MAT1-1-2、MAT1-1-1和MAT1-2-1编码的氨基酸序列与冬虫夏草的相应氨基酸序列相似性分别为89％、88％、84％和90％，是目前已知的与冬虫夏草在DN水平上相似性最高的物种。 本研究为雪峰虫草的人工培养提供了理论指导;雪峰虫草的交配型体系为研究有性繁殖和性别选择提供了新的模型，为更好地了解真菌的遗传提供了线索。

目录

摘要

第一章绪论

1．1概述

1．2虫草无性型及其分类鉴定

1．3虫草的有效成分及其应用研究

1．4虫草的人工栽培与发酵培养

1．5虫草交配型基因与TAIL-PCR技术

1．6研究的目的和意义

第二章雪峰虫草菌的生物学特性

2．1实验材料

2．1．1菌种及其来源

2．1．2仪器与试剂

2．1．3培养基

2．2实验方法

2．2．1雪峰虫草菌株的分离

2．2．2雪峰虫草形态学鉴定

2．2．4 ITS区段的扩增与序列分析

2．2．5雪峰虫草交配型的快速鉴定

2．2．6雪峰虫草菌株子实体的培养

2．3结果与分析

2．3．1雪峰虫草的分离鉴定

2．3．2雪峰虫草菌株子座的培养

2．4讨论

第三章雪峰虫草液体发酵与人工培育

3．1实验材料

3．1．1菌种及其来源

3．2实验方法

3．2．1菌丝体液体发酵培养基优化试验设计

3．2．2雪峰虫草菌株子座培养条件的优化

3．3结果与分析

3．3．1菌丝体液体发酵培养基优化

3．3．2雪峰虫草菌株子座的人工培养

3．4讨论

第四章雪峰虫草核苷类成分含量分析

4．1材料与方法

4．1．1实验材料

4．1．2实验方法

4．2结果与分析

4．2．1核苷与碱基组成分析

4．2．2其它有效成分检测结果

4．3讨论

第五章雪峰虫草交配型基因的克隆与分析

5．1材料、试剂与仪器

5．2实验方法

5．2．1生物信息学分析的主要软件与数据库

5．2．2雪峰虫草交配型MAT1-1和MAT1-2序列的全长克隆

5．2．3 Southern印迹杂交方法

5．2．4 RNA制备和cDNA合成

5．3结果与分析

5．3．1雪峰虫草交配型MAT1-1的克隆和分析

5．3．2雪峰虫草交配型MAT1-2的克隆和分析

5．3．3雪峰虫草交配型MAT基因座的分析

5．4讨论

第六章结论与展望

6．1研究结论

6．2特色与创新之处

6．3展望

参考文献

附录

论文发表情况

致谢

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